11.2.-INGENIERÍA GENÉTICA MANIPULACIÓN GENÉTICA CLONACIÓN GÉNICA TÉCNICA DEL ADN RECOMBINANTE Conjuntos de técnicas que permiten manipular el genoma de un ser vivo. Para ello debemos: Aislar un gen (gen pasajero) Introducirlo en otro ser vivo que no lo poseía o no le funcionaba bien. O en un microorganismo para clonar y traducir. ≠Clonación molecular ≠ Clon. celular ≠ Clon. Reprod.

INGENIERÍA GENÉTICA ¿Cómo introducir un gen? Se puede realizar de forma: Directa por: Microinyección: En animales justo en el momento de la fecundación en el pronúcleo masculino Electroporación: Uso de carga eléctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. Acelerador de Partículas (Gene Gun). Un cañón artificial bombardea micropartículas con el ADN, sobre la célula. Recombinación génica: ADN recombinante: ADN pasajero junto al vector transportador.

MICROINYECCIÓN Inyectar tres genes ¿? en el corazón que transformarían la cicatriz en músculo (Todd Rosengart, del Baylor College, Enero 2013). Efecto reforzante en estudios animales, si se combina con el gen VEGF [factor de crecimiento endotelial vascular]". Este gen es el responsable de la angiogénesis: creación de vasos sanguíneos: se tendría el músculo y las vías para irrigarlo.

VECTORES TRANSPORTADORES Y CÉLULAS CLONADORAS ADN PASAJERO: GEN QUE SE QUIERE INTRODUCIR VECTORES TRANSPORTADORES: Plásmidos Cósmidos CÉLULAS CLONADORAS: Bacterias Levaduras

PLÁSMIDOS Ó EPISOMAS Son pequeñas moléculas de ADN circulares. Al insertarse: Episoma No pertenece al genoma bacteriano. El episoma SI Confiere a la bacteria características añadidas, como por ejemplo resistencia a antibióticos. Pueden ser transferidos entre bacterias. Ejemplo especial es el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, con capacidad de penetrar en células de plantas.

INGENIERÍA GENÉTICA: VECTORES TRANSPORTADORES Cósmido: Plásmido + gen de la cápside (bacteriofago) recombinante

VECTORES TRANSPORTADORES: PLÁSMIDOS Muy aumentado Nucleoide o Genóforo

INGENIERÍA GENÉTICA La bacteria Agrobacterium tumefaciens contiene un plásmido Ti, que posee los llamados genes onc. Cuando la bacteria infecta a la planta los genes onc se introducen en el ADN de la planta. Las células vegetales comienzan a crecer como si fueran cancerígenas (hormona del crecimiento). Agrobacterium se comporta , de esta forma, como un ingeniero genético natural. El científico se ha fijado en ésto y ha eliminado los genes onc y los sustituye por otros genes que interese clonar. Se consigue un sistema muy eficaz para introducir ADN interesante a la planta, al mismo tiempo que se habrá evitado la aparición de la enfermedad.

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS CLONADORAS CON ADN RECOMBINANTE 1) RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS 2) PROTEINA AZUL

LEVADURAS: CLONADORES Son organismos unicelulares eucariotas Pertenecen al reino Fungi (Hongos) Son importantes en ingeniería genética por: La fermentación alcohólica. Genoma simple y conocido. Su manipulación genética es rápida y económica. Se introduce fácilmente el gen que codifica para la proteína de interés

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Son “tijeras moleculares” De forma natural se encuentran en las bacterias como medio de defensa frente a la penetración del ADN vírico. Catalizan la hidrólisis de la doble cadena de ADN en unos lugares muy específicos. Endonucleasas Por estos lugares “cortan” y quedan unos lugares, varias bases, nitrogenadas que se denominan segmentos cohesivos La primera en descubrirse fue la Eco R1 (Arber, Smith y Nathans, premio Nóbel en 1978). El primer transgénico fue la bacteria Escherichia coli a la que le introdujeron un gen que eresaba el ARNr 28 S del sapo Xenopus (Berg, Cohen y Boyer, 1973).

FORMACIÓN DEL ADN RECOMBINANTE 1.- Aislamiento del gen pasajero y selección del vector transportador que tiene incorporado un identificador (chivato). 2.- Se realizan múltiples copias del gen pasajero y del vector transportador que son tratados separadamente por enzimas de restricción que cortan ambos ADN por lugares específicos o segmentos cohesivos. 3.- Las enzimas de restricción EcoR1, Bam H1 son “tijeras moleculares”. 4.- Se ponen en contacto los fragmentos de ADN pasajeros y los vectores transportadores junto al enzima ADN ligasa. Así conseguimos formar el ADN recombinante. 5.- Se introducen como plásmidos en células clonadoras

TERAPIA GÉNICA HUMANA La terapia consiste en tratar al animal con un virus cuyo ADN ha sido modificado: sus genes virales han sido sustituidos por uno de los genes más importantes para el envejecimiento: el que codifica la enzima telomerasa. (2012)

TERAPIA GÉNICA Transferir un gen humano normal a una bacteria para clonar y obtener: Una hormona: insulina, hormona del crecimiento. Una proteína: interferón, factor VIII de coagulación. Vacunas: Hepatitis B, Sarampión, Cólera, SIDA, rabia.. Transferir el gen correcto directamente: Angioge. Transferir a células somáticas el gen correcto, por microinyecciones o por vehículos específicos: Talasemia (problemas con las células madre). ADA (Niños burbujas) Linfocitos T. 13 casos/ 2 leuc Cáncer, hemofilia... Incorrecto receptor VIH. Transferir el gen correcto a la línea germinal o al cigoto…Reproducción asistida. Producción de células madre: Desdiferenciación.

11.3.- TERAPIA GÉNICA HUMANA PRODUCTO SISTEMA DE PRODUCCIÓN INDICACIÓN TERAPÉUTICA ANTICOAGULANTES Escherichia coli Infarto de miocardio HIRUDINA Saccharomyces Prevención de trombosis INSULINA Escherichia coli / Saccharomyces Diabetes HORMONA DEL CRECIMIENTO Retraso del crecimiento y Síndrome de Turner HORMONA PARATIROIDEA Osteoporosis CALCITONINA Enfermedad de Plaget GLUCAGÓN Hipoglucemia F. HEMATOPOYÉTICOS INTERFERÓN Hepatitis B y C INTERLEUQUINA Cáncer de riñón VACUNAS: ANTIHEPATITIS A y B Prevención de hepatitis A y B

MICROINYECCIONES IN VITRO Investigación y Ciencia Julio 2013

TRATAMIENTO CONTRA EL CÁNCER Inactivar oncogenes. - Introducir genes supresores de tumores. - Introducir genes suicidas. - Introducir genes que aumenten sensibilidad a fármacos. - Introducir genes para diferenciar Célula de neuroblastoma (cáncer) transfectada (epigenética) con el gen de la histona metiltransferasa : recuperar la actividad de este enzima induce diferenciación glial

PROYECTO GENOMA HUMANO Genoma: Conjunto de genes del ser humano, realizado en células sanguíneas y espermáticas. Comenzó en EEUU en 1990 y su objetivo era secuenciar completamente el ADN humano. Competencia pública-privada: Finalizó en 2000. Los datos públicos siempre eran conocidos Se compone de 3x109 pares de bases A, C, G y T. 3000 libros de 500 hojas.

PROYECTO GENOMA HUMANO PGH Identificar los aproximadamente 25.000 genes humanos del DNA. Determinar la secuencia de los 3.200 millones de bases nitrogenadas que conforman los nucleótidos del   DNA. Acumular la información en bases de datos Desarrollar de modo rápido y eficiente tecnologías de secuenciación, hibridación, marcadores, etc.). Desarrollar herramientas para análisis de datos. Discutir las cuestiones éticas, legales y sociales que se derivan del proyecto.

PROTEÓMICA Proteoma: Conjunto de proteínas que se expresan de un genoma y que varía según el estado en el que se encuentre la célula: estrés, bajo el efecto de fármacos, de una hormona, de un neurotransmisor… Proteómica: Ciencia que correlaciona las proteínas con sus genes ó el estudio y caracterización de todo el conjunto de proteínas expresadas de un genoma. 20-25.000 genes, pero unas 100-200.000 polipéptidos

APLICACIONES PROTEÓMICA Biomarcadores de diagnóstico precoz y pronóstico de múltiples enfermedades: Cáncer, Ictus, Alzheimer, Parkinson, Epilepsia. Encontrar marcadores protéicos de: Diferenciación de especies. Desarrollo tisular y celular (Ingen. Genética) Evaluación de fármacos o de sustancias con potencial farmacológico. Determinación de potencial toxicológico.

APLICACIONES PROTEÓMICA Ecológica: Conocer la interacción a nivel molecular de los organismos con su medio: adaptación y evolución. Terapia celular y génica al descubrir nuevas dianas terapéuticas (Células iPS y Factores de transcripción). Determinación de mecanismos moleculares involucrados en el origen de las enfermedades. (PATOGENIA)