Hooke, Micrographia (1664) Mikeladze-Davi et al, Cell (2005) Microscopía Hooke, Micrographia (1664) Mikeladze-Davi et al, Cell (2005)

http://micro.magnet.fsu.edu/ http://www.zeiss.com/micro Carl Zeiss 1857 http://micro.magnet.fsu.edu/ http://www.zeiss.com/micro

Robert Hooke’s Micrographia (1664) http://archive.nlm.nih.gov/proj/ttp/intro.htm

Limitación por la long.de onda 0.4 um luz violeta 0.7 um luz roja Limitación por la long.de onda

Partes de un microscopio óptico http://www.microscopyu.com Nikon Eclipse 600

Magnificación

Apertura numérica (AN) = n X sen

función de dispersión de punto 3D (point spread function) Límite de resolución = 0,61 X λ AN función de dispersión de punto 3D (point spread function)

Microscopía óptica Tipos de microscopía Microscopía de campo claro (coloreado) Contraste de fase Microscopía de contraste de interferencia (DIC) Microscopía de fluorescencia

Objetivos de microscopía óptica

Microscopía de campo claro Absorción : es la disminución en la amplitud de onda cuando esta pasa a través de un objeto . La mayoría de las células muestran muy baja absorción con la luz visible. Esto resulta en la naturaleza transparente del objeto bajo la luz del microscopio, y en un contraste pobre.

Microscopía de campo claro (preparados coloreados) Microscopía óptica normal (de campo brillante coloreado): El material a observar se colorea con colorantes específicos que aumentan el contraste y revelan detalles que no aprecian de otra manera Microscopía de campo brillante: el material se observa sin coloración. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estén naturalmente coloreados.

Microscopía de contraste de fase Las zonas coloreadas reducen la amplitud de ondas de luz de determinadas longitud que pasan a traves de ellas. B) La luz que pasa a través de una célula experimenta poco cambio en su amplitud. Sin embargo hay un cambio de fase al pasar a través de la célula y estos cambios se hacen visibles explotando los efectos de interferencia

Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal para espécimenes delgados, o células aisladas. El microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz. En el microscopio de fase el cono de luz entra en el campo de visión del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción de un espécimen transparente, haciéndolo visible.

Microscopía de contraste de interferencia (DIC) Nomarski - DIC. Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imágenes combinadas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Fue diseñado para observar relieves de especimenes muy difíciles de manejar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilización in-vitro actuales. DIC se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar contraste de fases

Microscopía de Fluorescencia Las moléculas fluorescentes absorben luz a una determinada longitud de onda y emiten a otra

Fuente : lámpara de mercurio Células epiteliales , triple coloración: núcleo (azul), microtubulos (verdes), actina (rojo). 200X (arr.) y 1000X  (ab)

Microscopia confocal

Seccionamiento óptico Polen

Detectores electrónicos de luz Ambos dispositivos emplean una superficie fotosensible que captura los fotones incidentes y genera cargas electrónicas que son sensadas y amplificadas.

Binning Chip = 1360 x 1024 pixels La resolución de una cámara depende del tamaño y numero de pixeles del chip. Binning Chip = 1360 x 1024 pixels

El rango dinámico: parámetro relacionado con la capacidad de captar diferencias cuantitativas entre la señal mas débil y la mas intensa