Región que se desea amplificar por PCR 5´ 3´ 3´ 5´ Selección de los Oligos ( Primers ) 5´ 3´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Primera Etapa ( Desnaturalización ) : Se separan las Cadenas de DNA aumentando la temperatura hasta unos 94ºC 5´ 3´ 5´ 3´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Segunda Etapa ( Hibridación ) : Se reduce rápidamente la temperatura hasta 50ºC – 60ºC de tal forma que no se rehibridan las cadenas largas de DNA entre sí, pero se hibridan con los Oligos. 5´ 3´ 5´ 3´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Tercera Etapa ( Extensión ) : Llevando la temperatura a unos 72ºC se extienden las Cadenas de DNA 5´ 3´ 5´ 3´ Ha finalizado el primer ciclo de la PCR. Una PCR consiste básicamente en la repetición “n” veces de este ciclo. Por ejemplo lo podemos repetir 25 veces. La PCR tendrá 25 ciclos. Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Segundo Ciclo : Primera etapa ( desnaturalización ) a 94ºC 5´ 3´ 5´ 3´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Segundo Ciclo : Segunda etapa ( hibridación ) a 50ºC – 60ºC 5´ 3´ 5´ 3´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Segundo Ciclo : Tercera Etapa ( Extensión ) : Llevando la temperatura a unos 72ºC se extienden las Cadenas de DNA 5´ 3´ 5´ 3´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Tercer Ciclo : Primera etapa ( desnaturalización ) a 94ºC 5´ 3´ 5´ 3´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Tercer Ciclo : Segunda Etapa ( Hibridación ) : Se reduce rápidamente la temperatura hasta 50ºC – 60ºC 5´ 3´ 5´ 3´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Región que se desea amplificar por PCR ¿ Como se realiza la Selección de Oligos en la PCR ? Los oligos son secuencias complementarias a cada cadena de DNA Región que se desea amplificar por PCR ATGGCTACAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCC.....TGGCTTTTGGCCTGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGCCCTGGCTTCAAGAGGGCAGTGCC TACCGATGTCCGAGGGCCTGCAGGGACGAGGACCGAGGGCCTGCAGGGACGAGG.....ACCGAAAACCGGACGAAAACCGGACGAGACGGACGGGACCGAAGTTCTCCCGTCACGG Forward Primer Es el Oligo 5´ Reverse Primer Es el Oligo 3´ Debemos seleccionar dentro de las secuencias indicada 2 oligos de 18 a 25 bases La Tm de los oligos debe estar entre 55ºC y 65ºC Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

La Tm es la Melting Temperature ( Temperatura de fusión ), a la cual se separan la mitad de las bases de las 2 cadenas de DNA 1.0 A260 0.75 0.5 75ºC 80ºC 85ºC 90ºC 95ºC Tm Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

La Tm se incrementa con el porcentaje de G + C del DNA Para Oligos de tamaño entre 18 y 25 bases se puede calcular la Tm mediante una operación sencilla de cálculo : Tm = 2 ( A + T ) + 4 ( G + C ) La elección con frecuencia presenta dificultades adicionales, puesto que se deben cumplir varias condiciones : Ambos Oligos deben tener Tm parecidas No se deben formar horquillas ( hairpins ) dentro del mismo Oligo No se debe producir autodimerización de un oligo ni dimerización entre los 2 oligos Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Región que se desea amplificar por PCR Al final de la PCR tenemos una cantidad importante de la secuencia que queriamos amplificar. 5´ 3´ Región que se desea amplificar por PCR DNA MOLDE PCR Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

dNTPs : Una mezcla de los dNTPs ( dATP, dGTP, dCTP y dTTP ) Sin embargo resulta obvio que una Polimerización como esta requiere de otros elementos además del DNA molde y de los Oligos : dNTPs : Una mezcla de los dNTPs ( dATP, dGTP, dCTP y dTTP ) DNA Polimerasa : La técnica de PCR requiere que se produzcan sucesivos cambios de temperatura. Estos cambios van de los 95ºC a los 50ºC. La temperatura de 95ºC inactiva la mayoría de las enzimas. Por ello, el aspecto crucial en el desarrollo de esta técnica fue encontrar una DNA Polimerasa capaz de soportar estas temperaturas ( 95ºC ) y catalizar la polimerización del DNA a una temperatura superior a los 65ºC. Por ello la DNA Polimerasa de bacterias termales halladas en fuentes termales (Thermophilus aquaticus ) tuvo una importancia decisiva. De hecho, aunque actualmente existen varias DNA Polimerasas para PCR, La Polimerasa Taq (Thermophilus aquaticus ) se sigue utilizando. Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

PCR was developed by Kary Mullis. Kary Mullis is a scientist and surfer from Newport Beach, California. He won a Nobel Prize in Chemistry in 1993 for the development of PCR. He was working for Cetus Corporation in the 70’s and received $10,000 bonus for the idea. Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid