CROMATOGRAFÍA α = [moléculas adsorbidas] Fase estacionaria: sólido o líquido fijado a un sólido Fase móvil: fluído (líquido o gas) que arrastra la muestra a través de la fase estacionaria Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de manera diferente con las dos fases estableciéndose un reparto entre ambas Se establece un equilibrio entre partículas adsorbidas y desorbidas α = [moléculas adsorbidas] [mol. adsorbidas] + [mol. desorbidas] coeficiente de reparto

FASE MÓVIL FASE ESTACIONARIA

Clasificaciones de cromatografía 1. Según como se encuentre la fase estacionaria a. columna b. batch c. plana cromatografía en papel y en capa fina

2. Según el tipo de fase estacionaria y fase móvil Sólida Líquida o gaseosa Líquido adsorbido Líquida o gaseosa

3. Según el tipo de flujo empleado a. Gravedad b. Capilaridad (papel, capa fina) c. Fluído a presión (HPLC)

HPLC (high performance liquid chromatography) Se basa en los mismos principios que la cromatografía a baja presión Tiene mejor resolución, tiempos menores, mejor reproducibilidad El material empacado en las columnas está formado por pequeñas partículas de tamaño muy uniforme y gran rigidez Permite trabajar con flujos altos para lo que se requiere aplicar presión Se requiere de columnas especiales construidas en acero inoxidable o vidrio grueso

FPLC (fast protein liquid chromatography) Es una variante del HPLC con columnas y equipamiento especialmente diseñado para separar o purificar proteínas Las columnas de FPLC soportan menos presión que las de HPLC

4. Según la finalidad del experimento Separación y purificación Preparativa Separación, cuantificación y caracterización Analítica

4. Según la interacción entre la fase móvil y el soluto a. Cromatografía de intercambio iónico carga-carga b. Cromatografía de interacción hidrofóbica efecto hidrofóbico c. Cromatografía de afinidad variada pero específica enlaces covalentes d. Cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) e. Cromatografía de fase normal y reversa dipolos

Cromatografía de intercambio iónico La separación se basa en diferencias de carga a un pH dado Las interacciones son electrostáticas Dos tipos Intercambio aniónico: matriz cargada positivamente (DEAE, TEA, QAE) Intercambio catiónico: matriz cargada negativamente (carboximetilos, sulfonatos, fosfatos) Elución: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza iónica o ambos

Condiciones iniciales Aplicación de la muestra + - + - - + - + - - - + - - + - - - + - + - - - + + - - - - - - + - - + - - - + - + - + - + -

Aumento en la concentración de sales Elución de la proteína de interés - + - - + - + + - - - - - + - - + - - - - - - + + + + - - - - - - - - - - - + - - + - - - + - + - + - + -

Cromatografía de afinidad Se basa en una interacción biológica específica: Enzima-sustrato Anticuerpo-antígeno Enzima-coenzima Proteína-ligando específico La elución se puede lograr agregando el ligando (el que está unido a la columna) en solución o mediante cambios en el buffer que sean capaces de debilitar la interacción

IMAC (immobilized metal affinity chromatography) Se basa en la formación de enlaces de coordinación entre iones metálicos inmovilizados y grupos básicos en proteínas (histidinas) Principalmente a los iones divalentes de metales de transición como Fe, Co, Ni, Cu y Zn La elución se lleva a cabo adicionando quelantes más fuertes como el imidazol a distintas concentraciones o cambios en el pH

Es muy utilizada para la purificación de proteínas recombinantes Generalmente se adicionan 6 histidinas en el extremo Nt o en el Ct Cola de (Histidina)6 Ni2+

Cromatografía de interacción hidrofóbica El soporte está sustituído con cadenas alifáticas de 2 a 10 carbonos u otros grupos hidrofóbicos La interacción es de tipo hidrofóbica La fase móvil debe tener una alta concentración de sales ((NH4)2SO3 2 – 4 M) Salting out Para la elución se disminuye la concentración de sales en la fase móvil

Cromatografía de fase reversa Está muy relacionada con la cromatografía de interacción hidrofóbica pero son diferentes El soporte está sustituído por alifáticas pero más largas (8 -18 carbonos) y la densidad de sustituyentes es mayor La unión es más fuerte y por eso requiere mezclas con solventes no polares para la elución Desnaturaliza proteínas Se utiliza en HPLC

Gel filtración (cromatografía de exclusión molecular) No es una cromatografía La separación se da por tamaño

El gel debe ser inerte, de tamaño de poro definido y sin carga Múltiples aplicaciones: Cambios de buffer Separación de moléculas de bajo peso molecular de otras de mayor tamaño Determinación del peso molecular

Resultado final: cromatograma y y Velución (mL) Velución (mL) y = unidades de absorbancia, unidades de fluorescencia relativa, intensidad del pico (espectrometría de masa), entre otras

Concluyendo…. La pregunta más importante… ¿En qué son distintas las sustancias que deseo separar?