INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR: Red de Enfermedades Cardiovasculares Financia Ministerio de Salud, España RETOS ACTUALES EN INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR: Aspectos Metodológicos, Moleculares, Clínicos y Terapéuticos Coordinadores: Dr. Vicente Andres G arcía Dr. Juan J. Calvete Ch. Dra. Marta Casado P. Resumen de algunos aspectos de las conferencias Iván Palomo Valencia, Mayo 2004

Rectorado Universidad de Valencia Sede del curso de RECAVA

Necesidad de abordar la investigación cardiovascular Dr. Jordi Soler-Soler Coordinador RECAVA Necesidad de abordar la investigación cardiovascular de un modo multidisciplinar IAM 68.000 IAM/año (>Ca pulmón+colon+recto+mama) 34-40% de IAM llegan muertos al hospital 20% de IAM que llegan vivos al hospital mueren antes de 1 año. Factores de riesgo HTA 35% Tabaquismo 31% Hipercolesterolemia 21% Obesidad 19% Diabetes 11%

Clínico, Epidemiólogo, Básico Impacto del tratamiento Mortalidad Extrahospitalaria: Intrahospitalaria : 50% de los pacientes con IAM no presentan FR CV clásicos De los FR CV clásicos Más importantes: HTA e HiperCol Diferente mortalidad según territorios y razas Investigación CV Multidisciplinar: Clínico, Epidemiólogo, Básico Esfuerzo necesario

Técnicas de genómica para la identificación de Dr. Domingo Barettino IBV, CSIC Técnicas de genómica para la identificación de nuevos marcadores diagnósticos y dianas terapéuticas Genotipo Fenotipo Genoma (DNA) Transcriptoma (RNA) Proteoma Interactoma* * Interacción entre proteínas

Post-genómica Se conocen varios genomas completos Single Nucleotide Polymosphysm Genómica funcional: Investiga para que sirven los genes en diferentes tejidos Uso de Microarrays (Northern blot x n) Soportes Sondas Preparación RNA…cDNA ….Marcaje Adquisición datos y cuantificación Interpretación (Genómica funcional: sobre-expresión de genes)

Técnicas de proteómica para la identificación de Dr. Juan Calvete IBV, CSIC Técnicas de proteómica para la identificación de nuevos marcadores diagnósticos y dianas terapéuticas Genoma: múltiples proteomas (en diferentes tejidos) Comparan células en estudio vs células controles: - Electrof. bidimensional de proteínas: (1º por carga, 2º por tamaño) Análisis de 1 “mancha” a la vez (diferente entre cels. estudio y control) Proteína candidata a estudiar Digestión con tripsina ….software. Caracterización de péptidos (Secuencia aa): Espectrómetro de masas Pesquisa modificaciones post-traduccionales (glicosilaciones, fosforilaciones) - Electrof. unidimensional Si se analiza situaciones más simples

Diseño de vectores para modificación genética y Dra Marta Casado IBV, CSIC Diseño de vectores para modificación genética y generación de animales transgénicos Gen Proteína Modelo animal (Genómica) (Proteómica) Modelos celulares Modelos animales Transferencias directa de gen en animal adulto (transciente) Animales transgénicos Transgénesis clásica o aditiva Microinyección Rendimiento 1% Transgénesis sustractiva Knockout mouse Rendimiento <1%

Bases moleculares de la cardiopatía isquémica y Dra. Lina Badimón Centro de Investigación Cardiovascular U. Autónoma de Barcelona; Hosp. Santa Creu i Sant Pau, Barcelona (>150 ISI) Bases moleculares de la cardiopatía isquémica y experimental e identificación de marcadores diagnósticos y nuevas dianas terapéuticas Aterotrombosis Trombosis Adhesión y agregación plaquetaria, c/s participación del Sist. Coagulación Vilahur G, Duran X, Juan-Babot O, Casani L, Badimon L. Antithrombotic effects of saratin on human atherosclerotic plaques. Thromb Haemost. 2004 Jul;92(1):191-200. Pedreno J, Hurt-Camejo E, Wiklund O, Badimon L, Masana L. Platelet function in patients with familial hypertriglyceridemia: evidence that platelet reactivity is modulated by apolipoprotein E content of very-low-density lipoprotein particles.Metabolism. 2000;49(7):942-9.

Genes en el endotelio son regulados por elementos de la sangre Dra. Badimón (cont.) Genes en el endotelio son regulados por elementos de la sangre PYP51 y ERG25: Participan en el metabolismo del colesterol. Rodriguez C, Raposo B, Martinez-Gonzalez J, Llorente-Cortes V, Vilahur G, Badimon L. Modulation of ERG25 expression by LDL in vascular cells. Cardiovasc Res. 2003;58(1):178-85. NOR-1: Factor de transcripción Se expresa paredes vasculares con placa ateromatosa. LDL regula la expresión de NOR-1. Rius J, Martinez-Gonzalez J, Crespo J, Badimon L. Involvement of neuron-derived orphan receptor-1 (NOR-1) in LDL-induced mitogenic stimulus in vascular smooth muscle cells: role of CREB. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24(4):697-702. Lisil Oxidasa (LOx): En la maduración del endotelio (fase inicial de la placa) Rodriguez C, Raposo B, Martinez-Gonzalez J, Casani L, Badimon L. Low density lipoproteins downregulate lysyl oxidase in vascular endothelial cells and the arterial wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002;22(9):1409-14.

Otras líneas de investigación Dra. Bamidón (cont.) Otras líneas de investigación Casani L, Segales E, Vilahur G, Bayes De Luna A, Badimon L.Moderate Daily Intake of Red Wine Inhibits Mural Thrombosis a nd Monocyte Tissue Factor Expression in an Experimental Porcine Model. Circulation. 2004 Vilahur G, Segales E, Casani L, Badimon L. A novel anti-ischemic nitric oxide donor inhibits thrombosis without modifying haemodynamic parameters. Thromb Haemost. 2004 May;91(5):1035- 43. Royo T, Martinez-Gonzalez J, Vilahur G, Badimon L.Differential intracellular trafficking of von Willebrand factor (vWF) and vWF propeptide in porcine endothelial cells lacking Weibel-Palade bodies and in human endothelial cells. Atherosclerosis. 2003 Mar;167(1):55-63. Factores de riesgo emergentes PCR CD40L (plaquetas activadas, células endoteliales activadas) PAI-1 Investigación en animales Citometría de flujo Microscopía confocal Proteómica PCR real time Transgénicos (pendiente)

Hipertensión arterial y Patología Dr. Josep Redón Hosp. Clínico de valencia Hipertensión arterial y Patología HTA: Mayor causa de morbimortalidad de todos los países (D y SD) Mas que Tabaquismo e Hipercolesterolemia. Impacto sobre varios órganos diana: Vasos sanguíneos (Moléculas de adhesión solubles: VCAM-1, E-selectina) Cerebro Corazón Riñones Fisiopatología de la HTA

Alteraciones en la señalización y regulación de Dr. Federico Mayor Centro de Biología Molecular; U. Autónoma de Madrid Alteraciones en la señalización y regulación de receptores acoplados a proteínas G en las ECV >1000 Receptores acoplados a Proteína G () Arrestinas y GRK: Bloquean la interacción de receptor-ligando con proteína G. Gatillarían otros procesos Reclutamiento de proteínas citoplasmáticas: Clatrina AP-2 Otras Mayor F Jr, Penela P, Ruiz-Gomez A. Role of G Protein-Coupled Receptor Kinase 2 and Arrestins in beta-Adrenergic Receptor Internalization. Trends Cardiovasc Med. 1998;8(5):234-40.              

Epidemiología CV: del DNA al acontecimiento coronario Dr. Jaume Marrugat Institut Municipal d’Investigació Mèdica, Barcelona Epidemiología CV: del DNA al acontecimiento coronario Disminución de infecciones y aumento ECV Aterotrombosis: Mayor causa de muerte en el mundo. Manifestaciones clínicas mayores: Accidente cerebrovascular IAM (H:M=3:1) TVP (vasculopatía periférica) Mortalidad por cardiopatía isquémica: Mayor en noreste de Europa, respecto a países del mediterráneo. Mayor variabilidad inter-países que intra-países.

Durante los últimos 20 años incidencia de ECV estable: Dr. Marrugat (cont.) En España Durante los últimos 20 años incidencia de ECV estable: H: 184/100.000 habitantes M: 30/100.000 habitantes Por prevención secundaria y tto terciario. (No existiría prevención primaria) Tabaquismo Mortalidad Incidencia Prevalencia Aumento del número de pacientes que requieren servicios de salud. No cura. En 20 años altas se han multiplicado

Tipos de Placas ateromatosas Dr. Marrugat (cont.) Tipos de Placas ateromatosas Clasificación histológica (6 tipos) 1-4 : relativamente estables 5, 6: Inestables Muertos por IAM (España): Solo placas 1-4 ¿Placas evolucionan más lentamente? ¿Son más estables? Adaptación de las tablas de Framingham a población española (Estimación de riesgo coronario a 10 años) Sexo Colesterolemia, HDL-Col Tabaquismo Diabetes www.regicor.org (tablas y publicaciones)

Bases moleculares y celulares de la adhesión y migración Dra. María Yañez Hospital de la Princesa, U. Autónoma de Madrid Bases moleculares y celulares de la adhesión y migración transendotelial de leucocitos en patologías inflamatorias crónicas Membrana plasmática Intracelular Región rica en C y S VLA -4 LFA-1 Región de unión a metales divalentes Extracelular α1 α4 β1 β2 Familia Integrinas Moléculas de adhesión celular (MAC) Membrana plasmática Intracelular ICAM-1 VCAM-1 Dominio Ig Extracelular Puentes di-sulfuro Intracelular Memb plasmática Región de unión a carbohidratos Extracelular Dominio tipo EGF SCR L E P Superfamilia Inmunoglobulinas Familia Selectinas

Modelo de las interacciones adhesivas que actúan Dra Yañez (cont.) Modelo de las interacciones adhesivas que actúan en la migración transendotelial En Leucocitos participan las siguientes moléculas Contacto al azar Rodar Adhesión firme Diapedesis Adhesión tisular a) L-Selectina b) SLex. otros carbohidratos Sialilados y fucosusilados a) α4 β1 b) LFA-1 c) CD-31 Α4 β7 (mucosas) a) α3 β1 b) α4 β1 a) α5 β5 En Cél. Endoteliales a) GlyCAM-1 CD-34 Mad CAM-1 (mucosas) b) E-Selectina P-Selectina VCAM-1 ICAM-1, ICAM-2 CD-31 Inductores: IL-2, IL-8, TNFα, MIP 1β ICAM-1 Epiligrina Fn (CS-1) Fn (RGD) Células endoteliales Lumen Vascular Leucocitos Flujo Sanguíneo Tejidos Quimiotractantes

Proteínas ERM (Ezrin, Radixin, Moesin; citoplasmáticas) Dra Yañez (cont.) Proteínas ERM (Ezrin, Radixin, Moesin; citoplasmáticas) ICAM-1 ERM Actina Tetraspaninas CD9 CD81 CD151 Adhesión Movilidad Coestimulación Asociación a otras proteínas de membrana (ICAM-1, VCAM-1) MAC: proteínas muy ubicuas (malas dianas) Imágenes de rolling y migración transendotelial Citometría de flujo Microscopía confocal

Desarrollo de biochips para el diagnóstico genético Dr. Miguel Pocovi Inst. Aragonés de Ciencias de la Salud, Saragoza Desarrollo de biochips para el diagnóstico genético de la hipercolesterolemia familiar Genes + ambiente = Hipercolesterolemia En Hipercolesterolemias monogénicas … Principalmente genes: LDL-R (>850 mutaciones) ApoB-100 ARH (estabilizadora de LDL-R) AYP7A1 Apo E Molecular characterization of familial hypercholesterolemia in Spain: identification of 39 novel and 77 recurrent mutations in LDLR. Mozas P, Castillo S, Tejedor D, Reyes G, Alonso R, Franco M, Saenz P, Fuentes F, Almagro F, Mata P, Pocovi M. Hum Mutat. 2004;24(2):187. Pocovi M, Civeira F, Alonso R, Mata P. Familial hypercholesterolemia in Spain: case-finding program, clinical and genetic aspects. Semin Vasc Med. 2004; 4(1):67-74. Garcia-Alvarez I, Castillo S, Mozas P, Tejedor D, Reyes G, Artieda M, Cenarro A, Alonso R, Mata P, Pocovi M, Civeira F. Differences in clinical presentation between subjects with a phenotype of familial hypercholesterolemia determined by defects in the LDL-receptor and defects in Apo B-100. Rev Esp Cardiol. 2003;56(8):769-74.

* * Biochip (microarray) para Hipercolesterolemia familiar Dr. Miguel Pocovi Biochip (microarray) para Hipercolesterolemia familiar LDL-R (>850 mutaciones) (Biotina) Denaturaión * Sondas específicas (25 nucleótidos) (con diferentes mutaciones) Estreptavidina * Fluorocromo Progénica

Interacción entre Óxido nítrico (NO) y Metaloproteínasas Dr. Santiago Lamas Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares,, Madrid Interacción entre Óxido nítrico (NO) y Metaloproteínasas en el Endotelio vascular Metaloproteinasas de matriz (MMP) Familia de enzimas Acción en remodelación y reparación de tejidos. Capacidad de degradar proteínas de sostén Colagenasa-3 (MMP-13) Interés en proceso inflamatorio de la aterosclerosis El NO puede modular la expresión de MMP Induce acúmulo de MMP-13 en el frente de re-endotelización NO y MMP-13: primera etapa de la revascularización Knockout mouse en eNOS Microscopía confocal

Muerte celular durante la isquemia-reperfusión miocárdica Dr. David García-Dorado Laboratorio de Cardiología Experimental Hospital Universitari Vall d`Hebrón Muerte celular durante la isquemia-reperfusión miocárdica y desarrollo de tratamientos preventivos Necrosis Características Depende de severidad y duración de isquemia. En bandas de contracción. Durante primeros minutos de reperfusión. No se amplifica por apoptosis tardía (horas siguientes). Se puede prevenir en primeros minutos de reperfusión. Mecanismos Detención de la fosforilación oxidativa. Aumento de glicólisis anaerobia. Acumulación de metabolitos. Acidificación. Aumento de Na+ Ingreso de Ca2+

Miocitos en situación de “rigor isquémico” se contraen. Dr. David García-Dorado Miocitos en situación de “rigor isquémico” se contraen. 99 ISI Agullo L, Garcia-Dorado D, Escalona N, Ruiz-Meana M, Inserte J, Soler-Soler J. Effect of ischemia on soluble and particulate guanylyl cyclase-mediated cGMP synthesis in cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003;284(6):H2170-6.                         Ruiz-Meana M, Pina P, Garcia-Dorado D, Rodriguez-Sinovas A, Barba I, Miro E, Mirabet M, Soler-Soler J. GLYCINE PROTECTS CARDIOMYOCYTES AGAINST LETHAL REOXYGENATION INJURY BY INHIBITING MITOCHONDRIAL PERMEABILITY TRANSITION. J Physiol. 2004 Jun 24

Modelos experimentales de Aterosclerosis y Reestenosis: Dr. Vicente Andres Laboratorio de Biología Vascular Inst. de Biomedicina de Valencia (IBV) Modelos experimentales de Aterosclerosis y Reestenosis: Aspectos moleculares y terapéuticos Aterosclerosis: Proceso inflamatorio Proliferación y migración celular

¿Estas proteínas como dianas farmacológicas? Dr. Vicente Andres 60 ISI Andres V. Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signalling: new perspectives and therapeutic potential. Cardiovasc Res. 2004 Jul 1;63(1):11-21. Proteína Kinasa, ciclina dependiente (CDK) Proteínas inhibidoras de CDK (CDKIs) Migración celular ocurre preferentemente en fases G1/S. CDK y CDKIs regulan el ciclo celular Diez-Juan A, Andres V. The growth suppressor p27(Kip1) protects against diet-induced atherosclerosis. FASEB J. 2001;15(11):1989-95. p27 regula aterogénesis Polimorfismo (NTPs) de p27: C838A AA … Menos p27….IAM ¿Estas proteínas como dianas farmacológicas? Ej. Fármaco que aumente síntesis de p27 Modelo animal: knockout mouse para apoE Estudios de microarrays: varios componentes del S. Complemento se inducen en respuesta a hipercolesterolemia en ratones deficientes en apoE

Terapia celular para el tratamiento de la cardiopatía isquémica Dr. Francisco Fernandez Instituto de Ciencias del Corazón Terapia celular para el tratamiento de la cardiopatía isquémica La reperfusión precoz fracasa en el 50%. Miocitos no se regeneran. Estrategias celulares: Mioblastos de músculo estriado: No se integran bien en corazón. Stem cells de MO vía sanguínea colonizan corazón: Beneficio dudoso Stem cells localmente ….

Stem cells localmente, después de revascularización con stent 3/13 casos: reestenosis Mejor que solo con revascularización Falta: Estudios ramdomizados Investigación experimental *

Fotografía post-clausura del curso * * Dr. Jordi Soler Fotografía post-clausura del curso (60-70% de los asistentes al curso)

Café después de almuerzo. Frente al IBV Dr. Vicente A. García Dr. Juan J. Calvete Dra. Marta Casado Dr. Domingo Barettino Café después de almuerzo. Frente al IBV