TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENETICO: ENSAYOS DE RESTRICCION DE PLASMIDO Espinosa Muñiz José Carlos 2011-2

Endonucleasas de restricción Es una enzima que se caracteriza por reconocer una secuencia de 4 a 6 pb y cortarlas específicamente en ambas cadenas de la molécula del ADN.

Tipos de endonucleasas Tipo I Tipo II. Son las usados en biología molecular Tipo III

Tipo II Es la mas utilizada en biología molecular. Cortan sobre la secuencia que reconocen. Han perdido su capacidad de ser metilasas del DNA Cofactor Mg No ATP

¿porqué enzimas de restricción? Las endonucleasas son también llamadas enzimas de restricción debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por bacteriófagos. RESTRINGEN EL PASO DEL BACTERIÓFAGO. Son utilizadas para la eliminación de secuencias genómicas o para su introducción a un genoma (proteínas recombinantes)

Generalmente reconocen secuencias palindromicas, es decir, segmentos de DNA que se leen igual de derecha a izquierda y viceversa.

Extremos cohesivos Es cuando la enzima de restricción rompe la cadena del ADN en posiciones no simétricas y producen fragmentos con secuencias complementarias de una cadena.

Extremos romos Es cuando la enzima de restricción corta exactamente sobre los dos ejes de simetría.

Nomenclatura El nombre de estas enzimas esta asignado dependiendo su origen bacteriano. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa.

Eco RI  E = género Escherichia co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa identificada de esta cepa

Factores que afectan la reacción de restricción Se inhiben con los contaminantes que podemos encontrar en preparaciones de ADN (proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, sales)

Soluciones Si se aumenta la cantidad de enzima (10 a 20 U/µg DNA) incrementa el volumen de reacción, lo que diluye los inhibidores. Se puede aumentar la duración de la incubación. Adición de policationes (espermidina) uniéndose a contaminantes cargados -

¿Para que utilizamos enzimas de restricción en el DNA? Permite producir fragmentos definidos que se pueden separar mediante una electroforesis horizontal.

Un segmento de DNA contiene secuencias blanco para varias enzimas de restricción. Si el fragmento a analizar es extenso, se pueden utilizar una o mas enzimas de restricción (individual o mezcla)

Mapa de restricción Es un diagrama de la molécula de DNA en donde se muestra los sitios de corte de las enzimas de restricción. Se puede localizar secuencias de bases especificas en un cromosoma para estimar el grado de diferencia entre los cromosomas

En la práctica se utilizaran una mezcla de dos enzimas de restricción ya que el vector utilizado en la transformación no presenta dos sitios de restricción para la misma enzima.

SESIÓN EXPERIMENTAL

Objetivos Conocer el principio de separación y detección de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar ácidos nucleicos. Determinar el tamaño de fragmentos de ácidos nucleicos en geles de agarosa Conocer la utilidad de enzimas de restricción en la transformación genética y biotecnológica.

Materiales y reactivos DNA plasmidico purificado. Kit para electoforesis Ndel enzima de restricción que genera extremos cohesivos (ALMACENAR -20°C) Neisseria denitrificans 37°C BamHI enzima de restricción que genera extremos cohesivos (ALMACENAR -20°C) Curtobacterium albidum

Materiales y reactivos Amortiguador TANGO de restricción TAE 1X Agarosa Buffer de muestra Estándar de peso molecular Bromuro de etidio

Desarrollo experimental Colocar en un tubo de microfuga los siguientes reactivos: 10 µL de plasmido y 1 µL de amortiguador Tango 10x. Realizarlo por duplicado. Incubar 100°C por 5 min. Incubar en hielo por 5 min. Al tubo 1 agregar 1 µL de una de las enzimas de restricción (la indicada por el profesor). Mezclar. Al tubo 2 añadir 1 µL de BamHI y 1 µL de Ndel. Mezclar. Centrifugar por 5 segundos. Incubar a 37°C por 90 minutos. Al terminar la incubación, colocarlos en hielo. Tomar alícuota de 10 µL para correr el gel de agarosa.

Preparación del gel de agarosa Preparar el gel de agarosa al 1.2% (0.42 g agarosa + 35 mL de TAE 1X). Calentar hasta que se disuelva bien. Esperar a que la temperatura disminuya y agregar 2 µL de Bromuro de etidio (AGENTE MUTAGENICO)

Verter el gel sin formar burbujas. Dejar enfriar.

Añadir amortiguador TAE a la cámara hasta que se cubran los pozos hechos por los peines.

Preparación de muestras REACTIVOS E P R1 R2 MUESTRA 1 µL DNA 10 µL H2O 9 µL ----- BUFFER 2 µL Stop Mix 3 µL E: estándar P: plásmido sin digerir R1: plásmido digerido con una enzima R2: plásmido digerido con dos enzimas

DNA, Moléculas cargadas negativamente

Tomar 13 µL y colocarlos en los pozos.

Conectar a la fuente de poder a 80 V por 40 minutos. Observar el gel en una cámara de luz UV para visualizar las bandas de DNA