INTRODUCCIÓN 1. Ley de Lambert-Beer 2. Determinación de proteínas Absorbancia 280 Biuret Lowry Bradford BCA

PARTE II: REVISIÓN DE MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS Y ELABORACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DE PROTEÍNA Objetivos Aplicar un método espectrofotométrico para medir la concentración de una proteína. Conocer el manejo de micropipetas y espectrofotómetros. Construir curvas de calibración y comprender su importancia. Determinar el intervalo de sensibilidad de una curva estándar.

ESPECTROFOTOMETRÍA Definición Medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación. El espectrofotómetro es un instrumento que permite relacionar la radiación absorbida o transmitida por las moléculas en una solución cuya concentración es desconocida con una que contiene una cantidad conocida de moléculas

ESPECTROFOTÓMETRO

Ley de Lambert - Beer Relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado.

LEY DE LAMBERT Y BEER A = ε·c·l La ley explica que hay una relación entre la absorción de luz por una sustancia y la concentración de ésta, así como también con la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. A = ε·c·l Donde: A = absorbancia;  = Coeficiente de extinción molar; l = longitud de la celda.

COEFICIENTE DE EXTINCIÓN MOLAR Es una medida de la cantidad de luz absorbida por unidad de concentración. Un compuesto con un alto valor de coeficiente de extinción molar es muy eficiente para absorber luz a una cierta longitud de onda y, por lo tanto, puede detectarse al medir la absorción en soluciones muy diluidas.

Curva Patrón Es un marco de referencia que se construye a partir de cantidades conocidas de una sustancia en solución: por ejemplo la albúmina sérica bovina en agua

Limitaciones de L-B Linearidad limitada por factores químicos e instrumentales: Desviación del coeficiente de absortividad a altas concentraciones (>0.01M) por interacciones electrostáticas Difusión de la reflección por partículas suspendidas Fluorescencia o fosforescencia de la muestra Cambios en índice refractivo a altas concentraciones Cambios en el equilibrio químico por alta concentración Radiación no monocromática

Limitaciones de L-B

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS Comparación de métodos

Cuantificación de Proteínas Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta: cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.

Cuantificación de Proteínas Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, para la formación de derivados químicos, o la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.

PROTEÍNAS y la absorción en la región UV Las bandas de absorción más significativas se encuentra en el ultravioleta cercano, en el intervalo de longitud de onda entre 230 y 300 nm. Aminoácidos aromáticos, la histidina y la cistina. La cistina presenta una banda centrada a 250 nm.

Cálculo para obtener la concentración de proteína Coeficiente de extinción molar del BSA es 43,824 M-1cm-1 o bien Coeficiente de extinción molar del BSA 6.6 para una solución de BSA 1% (10mg/mL)

REACCIÓN DE BIURET La reacción debe su nombre al Biuret, una molécula formada a partir de dos moléculas de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2). Complejo con Cu2+

MÉTODO DE LOWRY Reacción de determinación de proteínas en dos pasos: Reacción de Biuret. La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina.

Reacción de Cu2+ en medio alcalino PRIMER PASO SEGUNDO PASO Enlaces peptídicos tirosina, triptófano, y en menor grado por cisteína, cistina e histidina. Reacción de Cu2+ en medio alcalino Reacción con el Folin-Cicalteau

LOWRY

LOWRY

Tinción de proteínas con Azul de Coomasie Ensayo en tubo del método de Bradford. Hacer curva patrón Tinción de proteínas en gel de poliacrilamida- SDS

BRADFORD Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 μg), simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.

EL AZUL DE COOMASIE Y LOS AMINOÁCIDOS QUE RECONOCE

CAMBIO DE ABSORBANCIA DEL AZUL DE COOMASIE Coomasie libre Coomasie-proteína (catiónico) (aniónico)

BRADFORD

BCA

BCA Combina la reducción de Cu2+ a Cu1+ por la porteína en medio alcalino con la detección del catión cuproso (Cu1+) por el ácido bicinchonínico (Rxn de Biuret). Primer paso: quelación de cobre por la proteína en medio alcalino. Los péptidos que contienen tres o más residuos de aa forman un complejo quelado con el cobre y tartrato de sodio. Segundo paso: BCA reacciona con (Cu1+). Dos moléculas de BCA por ión cuproso. Desarrollo de color púrpura. Lectura a 562 nm. Formación de color influenciado por cisteína, cistina, tirosina y triptófano. A diferencia de métodos con Coomasie (Bradford) el esqueleto peptídico también contribuye a la formación de color, disminuyendo la variablidad.

Cuadro comparativo de sensibilidad de las técnicas de cuantificación de Proteínas

El experimento…

Micropipetas

Micropipetas

TIPOS DE MICROPIPETAS Los tipos: P1000, P200, y P20. P1000 es útil para volúmenes de 200 hasta 1000 μL P200 es útil para volúmenes de 20 hasta 200 μL. P20 es útil para volúmenes de 0.5 hasta 20 μL. No Trate de colocar la micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para volúmenes menores del cero, esto descalibrará y dañará la micropipeta. Toda micropipeta utiliza puntas desechables (no utilice la pipeta sin usar la punta apropiada, hacer esto contaminará la micropipeta y la puede dañar). No utilizar la micropipeta con líquidos que atacan el polipropileno. No utilizar líquidos que estén emitiendo vapores. La temperatura de los líquidos debe estar entre 15 y 40 º C. Al poner la punta, asegúrese que la punta sea del tipo correcto y que esta correctamente ajustada. Generalmente para P1000 las puntas son azules, para P200 son amarillas y para P20 pueden ser amarillas o blancas.