CAMBIOS FISIOLÓGICOS Y MOLECULARES ASOCIADOS A LA BIOSÍNTESIS DE AROMAS DURANTE LA MADURACIÓN DEL DAMASCO (Prunus armeniaca L.) Mauricio González-Agüero 1*, Sebastián Troncoso 2, Orianne Gudenschwager 1, Reinaldo Campos-Vargas 1, Bruno G. Defilippi 1. 1 Laboratorio de Postcosecha, Instituto de Investigaciones Agropecuarias, CRI La Platina. 2 Facultad de Química y Biología, U. de Santiago de Chile. Estrategia experimental Resultados GSGS 61 G Conclusiones La pérdida de sabor durante la postcosecha de damasco (Prunus armeniaca L.), es una de las principales causas del deterioro de la calidad de esta fruta, en especial en su componente aromático, siendo un factor limitante para su comercialización. Al igual que en otras especies el desarrollo del aroma es un proceso dinámico por lo que se presentan diferencias importantes en los distintos estados de madurez de los frutos. Sin embargo, hasta la fecha estudios moleculares orientados a entender la biosíntesis de compuestos volátiles propios del damasco son muy escasos y la información disponible acerca de los procesos involucrados en la evolución del aroma en esta fruta es limitada. Como una primera aproximación en este trabajo se caracterizó fisiológicamente diferentes estados de maduración de damascos de la variedad Modesto, estableciendo cuatro estados claramente distinguibles entre sí. Posteriormente, la evolución de los volátiles aromáticos de estos cuatro estados se correlacionó con los perfiles de expresión de tres genes que codifican para enzimas responsables y claves en los procesos de biosíntesis de compuestos aromáticos: alcohol deshidrogenasa (ADH), lipoxigenasa (Lox) y piruvato decarboxilasa (PDC). En el caso particular de adh, a medida que avanza la maduración se observó un aumento en su expresión lo que se relacionaría directamente con la disminución medida para los aldehídos identificados (hexanal y hexenal). Creemos que la identificación y anotación de estos genes de P. armeniaca y el análisis de la expresión diferencial de sus transcritos durante la maduración del damasco son claves para entender la biosíntesis de volátiles responsables del aroma y su evolución durante la maduración de esta fruta. Damascos cv. Modesto Estados de maduración Evaluación de parámetros de calidad Caracterización de estados de madurez Genes analizados: ADH, Lox, PDC Búsqueda de secuencias ortólogas Obtención de secuencias completas (RACE-PCR) Generación de partidores para qPCR Perfiles de expresión de ADH, Lox y PDC Mediante PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR) Extracción de RNA, síntesis de cDNA 1. Caracterización de los estados de madurez: se analizaron frutos de la variedad Modesto cosechados en distintos periodos de tiempo, a los cuales se les evaluó: firmeza, sólidos solubles totales (SST), acidez titulable, tasa de producción de etileno y tasa respiratoria. De esta manera se determinaron cuatro estados de maduración claramente definidos. Estado de maduración Peso (g) Firmeza (Kgf) SST (%) Acidez (%Ac. Málico) Tasa etileno (µL C 2 H 4 / k*h) Tasa resp. (mL CO 2 /k*h) M1 31,22,910,12,20,060,2 M2 40,51,914,91,90,070,1 M3 45,12,016,91,51,458,1 M4 46,20,421,30,829,555,3 2. Determinación del patrón aromático característico para cada estado de maduración: se identificaron seis compuestos volátiles presentes en cada estado (M1 a M4) mediante GC-MS, los cuales fueron cuantificados con el uso de estándares y cromatografía gaseosa. 3. Identificar y clonar los genes adh, lox y pdc para P. armeniaca: para cada uno de los genes analizados se obtuvo la secuencia completa del transcrito codificante mediante RACE-PCR. En el panel A se ejemplifica el procedimiento experimental realizado para adh. En B se observa el alineamiento de la secuencia aminoacídica deducida para adh (267 aa) de P. armeniaca y sus ortólogos en otras especies vegetales (Prunus mume, Cucumis melo, Arabidopsis thaliana). Búsqueda de secuencias anotadas que codifican para ADH en otras especies vegetales relacionadas Diseño de partidores RACE-PCR Búsqueda de zonas conservadas AF ADH Pyrus communis, cds parcial (1.177 bp) AY ADH Prunus cerasus, cds completo (1.107 bp) AB ADH Prunus mume, cds completo (1.119 bp) AB 4. Análisis de los niveles de expresión de los genes adh, lox y pdc en los cuatro estados de maduración: se determinaron los patrones de expresión de los tres transcritos de P. armeniaca mediante real time (qPCR) en 4 frutas de cada estado de maduración. Los ensayos de amplificación fueron realizados en triplicado. La expresión de cada gen fue normalizada respecto a un control externo (gen dap de Bacilus subtilis) y graficada como el porcentaje del promedio para cada estado, relativo al valor de máxima expresión. Este trabajo fue financiado por el proyecto Fondecyt Glicólisis B-oxidación transaminación Piruvato Aldehídos Acetaldehído ADH PDC ADH Alcohol AAT Esteres - Cte - ?+ La expresión del gen aumenta La expresión del gen permanece constante ? Expresión aún no es analizada - + Nivel de detección de los compuestos aromáticos Cambios detectados entre los estados de maduración * Letras distintas muestran diferencias significativas de expresión (p<0,05) adhloxpdc HexanalHexenal Hexil acetatoLinalol Hexil alcohol Octanoato de etilo * Letras distintas muestran diferencias significativas (p<0,05)