Eloisa Jantus Lewintre HOSPITAL UNIVERSITARIO LA FE SERVICIO HEMATOLOGIA 2 de Octubre de 2008 Leucemia linfática crónica B: una enfermedad heterogénea. Estudio del rol de las mutaciones de IgVH y BCL-6 en esta heterogeneidad. Aproximaciones genómica y funcional. Eloisa Jantus Lewintre

INTRODUCCIÓN

LLC-B: GENERALIDADES La leucemia linfática crónica B (LLC-B) se define como: Enfermedad causada por la acumulación progresiva monoclonal de células B que co-expresan CD5+ y CD19+, originada a partir de linfocitos B maduros con experiencia antigénica. Actualmente se la describe como una enfermedad por acumulación de células B con un alto nivel de proliferación, mientras que anteriormente se creía que se debía a un defecto en la apoptosis de células inmuno-incompetentes. Curso clínico variable: Grupo de pacientes con enfermedad agresiva con necesidad de tratamiento Grupo de pacientes con enfermedad indolente Se presenta en edad avanzada (10-15% en < 50 años) Afecta más a hombres que a mujeres (1.5 : 1.0 ).

Desarrollo de Linfocitos B normales CD10 CD19 CD34 Pro B Pre B BCR Cel B inmadura M.O. D9 J4 V3

Vías de maduración de las células B: dependencia de células T Chiorazzi N, N Engl J Med 2005 BCL6 mutations AID

Selección por antígeno Desarrollo y evolución de las células de LLC-B Mutado Estim. antigénica No Mutado Selección por antígeno Lesión genética LLC clon mutado LLC clon no mutado HETEROGENEIDAD

FACTORES PRONÓSTICO EN LLC Estadíos de Binet o Rai Tiempo duplicación linfocitario Timidina-kinasa 2 microglobulina LDH Patrón histopatológico de médula ósea. Estado mutacional de IgVH Mutaciones en región 5’ no-codificante del gen BCL6 Expresión de CD38 Expresión de ZAP-70 Alteraciones citogenéticas (del 17p, del11q, del 13q, +12)

MUTACIONES SOMÁTICAS EN IgVH y BCL6 Hamblin TJ,. Blood. 1999 years years MESES 100 80 60 40 20 1,0 ,8 ,6 ,4 ,2 0,0 GRUPOS GRUPO I BCL6 + / IgVH+ GRUPO II BCL6 - / IgVH + GRUPO III BCL6 - / IgVH - Sarsotti E, Leukemia.2004 ILT No se pueden determinar de rutina en diagnóstico

EXPRESIÓN DE ZAP70 y CD38

HIPOTESIS OBJETIVO PRINCIPAL LLC: formas clínicas heterog. Subgrupos moleculares Influyen en evolución y necesidad de tratamiento (ptes en estadío A) Perfiles genómicos y funcionales DIFERENTES? OBJETIVO PRINCIPAL  Valorar la implicación de las mutaciones en los genes IgVH y BCL-6 como responsables de la heterogeneidad en el comportamiento biológico y expresión génica en la LLC-B e identificar nuevos marcadores subrogados de las mutaciones en IgVH y de pronóstico en estadíos tempranos de la enfermedad

CAPÍTULO I: ESTUDIOS FUNCIONALES OBJETIVOS: Evaluar el estado mutacional de IgVH en muestras de LLC mediante protocolo Biomed2 modificado y valorar su utilidad Secuenciar la región 5’ no codif del gen BCL6 y correlacionar polimorfismos y mutaciones en esta región con expresión. Realizar estudios de quimiosensibilidad in vitro con Btz y correlacionarlos con el estado mutacional de los genes IgVH y BCL6

LLC-B: diagnóstico NCI 1996 [Cheson, Blood,1996] Edad mediana: 67,4 años (42-86) 56.7% varones N=74 Estadío A de Binet Inmunofenotipo, CD38, ZAP70 por FC Alteraciones citogenéticas (FISH) Otros: score, TDL, LDH, 2microglob

ESTADO MUTACIONAL DEL GEN IgVH CDR1 CDR2 N Dominio variable Dominio constante CDR3 V D J mRNA (gen) Ig, cadena pesada (proteína) 6 VH-Leader Homología <98% MUT >98% NO-MUT

CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES EN IgVH Familia IgVH mutado No mutado VH3 44 % 3-7 6   VH1 24 % 1-69 3-23 1-3 4 3-30 5 1 1-2 3 2 3-30-3 1-8 3-33 1-58 3-9 TOTAL 8 10 3-72 VH4 19% 4-34 3-74 4-61 3-11 4-39 3-20 4-31 3-21 4-59 3-48 12 3-53 VH2 8% 2-5 3-64 VH5 3% 5-51 3-66 VH6 1.3% 6-1 26 7 Mutadas= 54 (73%) No mut= 20 (27.0%)

ESTADO MUTACIONAL DEL GEN BCL6   Representación esquemática del gen BCL-6. Los exones codificantes y no codificantes se representan por rectángulos llenos y vacíos, respectivamente. La región que sufre SHM y que hemos analizado aparece indicada por una línea azul. E1.10 E1.11 E1.12 E1.21C E1.26 741 pb E1.21C (sentido): CTC TTG CCA AAT GCT TTG E1.24 (antisentido): TAA TTC CCC TCC TTC CT E1.23 (sentido): AGG AAG GAG GGG AAT TAG E1.P1.6 (antisentido): AAG CAG TTT GCA AGC GAG E1.P1.7(sentido): TTC TCG CTT GCA AAC TGC E1.26 (antisentido) CAC GAT ACT TCA TCT CAT C

ESTUDIO DE LA REGION 5’ DEL GEN BCL6 100% IgVH mut 20 mutadas (29%) 34 mutaciones 31 mutac. diferentes Sustit. nucleót. C (35.3%) T (29.4%) G (26.5%) MUTACIONES N=69 POLIMORFISMOS delT 520 (29.0%) 397 G>C (17.4%) 502 G>A (7.2%)

MUTACIONES DEL GEN BCL6 Frecuencia de mutaciones Posición 2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 12 14 1-49 50-99 100-149 150-199 200-249 250-299 300-349 350-399 400-449 450-499 500-549 550-599 600-649 650-699 700-749 750-790 Posición Frecuencia de mutaciones

MUTACIONES Y EXPRESIÓN BCL6: RELACIÓN ENTRE MUTACIONES Y EXPRESIÓN Prueba estadística: Pearson

CULTIVOS CELULARES Control Stress oxidativo, Btz Control BAY 117082 BORTEZOMIB Stress oxidativo, Citoquinas (CD40 L, IL-4, IL-1, TNFa, otros) Infeccion viral/ bacteriana BCL2 24 hs 37ºC 5% CO2 RPMI 15% FBS APOPTOSIS Anexina V + PI

Inducción de apoptosis por Btz en células con IgVH mutado: correlación con mutaciones en BCL-6. Tratamiento Células con IgVH mutado: Mutaciones en BCL-6 n % Apoptosis (media  SEM) p* Btz 0.1 M IgVH mut/ BCL-6 no-mut 9 67.66  1.91   0.032 IgVH mut/ BCL-6 mut 11 51.59  4.61 Btz 1.0 M 8 73.84  2.59 0.034 62.12  3.44

CAPÍTULO II: ESTUDIOS GENÓMICOS OBJETIVOS: Estudiar la firma molecular de la LLC-B mediante el uso de micromatrices de alta densidad, identificando vías metabólicas o términos de ontología génica que estuvieran sobrerepresentados en esta patología. Estudiar el perfil de expresión génica en distintos grupos moleculares de LLC-B con el fin de identificar genes y vías metabólicas diferencialmente expresados. Validar los resultados obtenidos del estudio transcriptómico mediante RTqPCR.

Validación metodolog. por RTqPCR Células B seleccionadas ( CD19+ bolas inmunomagnéticas) 11 Controles sanos 36 muestras LLC-B estadío A de Binet (no tratados) * 24 IgVH mutado 15 BCL6 no mutado (G1) 9 BCL6 mutado (G2) * 12 IgVH no mutado (G3) CD19 Grupo INICIAL Micromatrices Validación metodolog. por RTqPCR IgVH mut=24 BCL6mut=9 IgVH no mut= 12 N=36 LLC-B: estadío A

METODOLOGÍA GENÓMICA Extracción de ARN total de linf B Datos Hibridación con Micromatrices de ADN (microarrays, chips) Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix) Extracción de ARN total de linf B Transcripción a ADNc Marcaje con fluorescencia Datos Suite GEPAS Montaner D, Nucleic Acids Res, 2006, 34:W486-91 Preprocesamiento: Normalización, QC Cluster jerárquico Expresión diferencial (estudio supervisado) -> prueba t Estudio de Anotación Funcional -> FatiScan

CONTROLES vs LLC

Cluster jerárquico – Método UPGMA LLC-B

FIRMA MOLECULAR LLC-B HG U133 2.0 Plus (Affymetrix) ASXL2 NEDD8 GLIPR1 SMAD3 POLB Proteína relacionada a patogén. en gllioma ->pro apoptotica en Ca de próstata y vejiga GLIPR1 POLR3B POLR2L ASXL2 NEDD8 SCLY Polimerasas involucr. en transcrip. Codif proteina similar a ubiquitina ->ciclo celular, embriogen. Gen asociado a carcinogen. Factor de transcrip esencial p/ todos los linajes hematopoy. RAD51L1 RBM14 POLE4 ERCC1 Repar. y replic. ADN FIRMA MOLECULAR LLC-B HG U133 2.0 Plus (Affymetrix) SIGLEC10 CLSTN1 HLADOB FCRL5 Proteína integr. membr.

ANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScan ACTIVADOS EN LEUCEMIA REPRIMIDOS EN CONTROLES Sínt de ATP acopl a transp de electrones Replicación ADN Recombinación ADN Reparación ADN Metabol. de nucleótidos Metabol. de hexosas Ciclo celular Fosforilación oxidativa Vía de las pentosas fosfato Ciclo del citrato GO KEGG ACTIVADOS EN CONTROLES REPRIMIDOS EN LEUCEMIA GO Muerte celular GO Diferenciación celular Apoptosis Proteólisis mediada por ubiquitina KEGG

G1 + G2 (IgVH mut) vs G3 (IgVH no mut)

MGC9913 RGS4 CRY1 DMD BCL7A LPL TUBA8 ITGA9 CRY1: componente del reloj circadiano BC7A (B-cell CLL/lymphoma 7A) involucrado en traslocaciones cromosóm. en linfomas no Hodgkin LPL: enzima del metabolismo lipídico. Formación y estabiliz de “lipid raft” en LLC CD82: gen supresor de metástasis BCL11A DUSP22 PDLIM5 SVH ADAM29 CD82 FUT8 DUSP22: fosfatasa dual. Activa vía JNK BCL11A: prot dedo de Zn, expresada en CG

ANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScan G1 + G2 (IgVH mut) vs. G3 (IgVH no mut) ACTIVADOS EN IgVH no mut REPRIMIDOS EN IgVH mut Señalización vía proteina G Procesos rítmicos Vía de señalización Frizzled-2 (WNT) Vía de señalización mediada por Ca Interacc ECM- receptor Vía de señalización Hedgehog Uniones tipo Gap Adhesión celular homofílica GO GO KEGG ACTIVADOS EN IgVH mut REPRIMIDOS EN IgVH no mut GO Regulac positiva de IkB kinasa Metabol glicerolipídico Ribosoma GO Apoptosis KEGG

Expresión diferencial - FatiScan G1 (IgVH mut/ BCL6 no mut) vs. G2 (IgVH mut/ BCL6 mut) No hay genes expresados significativamente de manera diferencial

MET. DE VALIDACIÓN: PCR cuantitat. a tiempo real Genes validados (N=14)   Valor Expresión Normalizado= ETCpT(C)-CpT(S)x ERCpR(S)-CpR(C) ET = Efic.del gen diana ER = Efic. del gen de referencia CpT ciclo umbral del gen diana CpR ciclo umbral del gen de referencia C=Calibrador ; S= muestra

Validación de resultados: Cuantificación de mRNA por RTqPCR IgV H Gen No mut (media + 2SEM) Mut p (prueba de Mann Whitney) CRY1 0.335 + 0.114 0.075 + 0.050 <0.001 LPL 297.01 + 89.32 53.62 + 44.86 MGC9913 1.96 + 1.193 0.308 + 0.302 BCL7A 0.2512 + 0.128 0.062 + 0.038 0.002 IFT57 0.919 +1.718 0.647 + 0.170 0.007 FUT8 0.966 +0.334 1.841 + 0.370 DUSP22 0.649 + 0.361 1.383 + 0.504 0.008 BCL11A 0.641 + 0.140 0.937 + 0.160 CD82 0.359 + 0.100 1.044 + 0.382 0.011 ITGA9 0.381 + 0.122 0.221 + 0.070 0.025 ZAP70* 0.412 + 0.384 0.151 + 0.056 0.033 FAHD1 0.855 + 0.214 1.259 + 0.196 0.037 PDLIM5 0.684 + 0.136 0.961 + 0.192 0.049 SVH 1.051 + 0.252 1.689 + 0.394 * No signif. estadíst. en datos de micromatrices

MARCADORES PRONÓSTICO CAPÍTULO III: MARCADORES PRONÓSTICO EN LLC-B OBJETIVOS: Validar biológicamente los marcadores identificados en un grupo muestral independiente. 2. Valorar la utilidad de los genes seleccionados como marcadores subrogados del estado mutacional de IgVH y de pronóstico en estadíos tempranos de la LLC-B

Grupo INICIAL Micromatrices N=36 Grupo VALIDACIÓN N=38 Validación metodolog. por RTqPCR IgVH mut=24 BCL6mut=9 IgVH no mut= 12 N=36 Grupo VALIDACIÓN Validación BIOLÓGICA RTqPCR N=38 IgVH mut=30 BCL6mut=11 IgVH no mut= 8 LLC-B: estadío A Marcador Subrogado IgVH N=74 Marcador Pronóstico (ILT) IgVH mut=54 IgVH no mut= 20

del grupo de validación Correlación entre expresión relativa y estado mutacional de IgVH en muestras del grupo de validación IgV H Gen No mut (media + 2SEM) Mut p (prueba de Mann Whitney) CRY1 0.275 + 0.114 0.055 + 0.004 <0.001 LPL 228.4 + 59.6 20.11 + 13.72 BCL7A 1.44 + 0.742 0.073 + 0.042 ZAP70 0.661 + 0.418 0.071 + 0.052 CD82 0.433 + 0.076 0.689 + 0.112 0.013 DUSP22 1.18 + 0.38 1.90 + 0.30 0.023

Marcadores subrogados de IgVH Sensibilidad, especificidad, y área bajo la curva ROC en grupo de validación

Expresión de genes seleccionados y estado mutacional del gen IgVH % p (Chi cuadrado) > 0.090 19 27.1 4 5.7 CRY1 <0.090 1 1.4 46 65.7 92.8 <0.0001 82.45 20 28.2 6 8.5 LPL <82.45 0.0 45 63.4 91.6 0.105 12 16.9 ZAP70 <0.105 39 54.9 83.1 <0.115 17 23.9 10 14.1 BCL7A 0.115 3 4.2 41 57.7 81.6

CRY1 y LPL como marcadores subrogados del estado mutacional de IgVH No mut Mut IgVH CRY1 y LPL como marcadores subrogados del estado mutacional de IgVH Las barras de error representan el 95% del intervalo de confianza. La línea roja muestra el valor de corte para cada parámetro

Curvas de Kaplan-Meier: Mutaciones en IgVH Actualm. usado en clínica. La significación estadística de las diferencias entre curvas fue evaluada por la prueba Log-rank.

Curvas de Kaplan-Meier: LPL, CRY1 y ZAP70 ZAP70-RTqPCR p=0.001

CRY1: ¿NUEVO BIOMARCADOR EN LLC-B CRY1: ¿NUEVO BIOMARCADOR EN LLC-B? Correlación con la expresión de ZAP70 o LPL y estado mutacional de IgVH   CRY1 + CRY1 - ZAP70 qPCR + 22 10 ZAP70 qPCR - 1 38 15.5% discordancias 19 IgVH No mut 3 IgVH Mut 2= ZAP70 FC+ CD38+ 9 IgVH Mut 1 IgVH No mut 1 IgVH Mut CD38+ 38 IgVH Mut   CRY1 + CRY1 - LPL + 21 5 LPL - 2 42 10.0% discordancias 20 IgVH No mut 1 IgVH Mut 1= ZAP70 FC+ CD38+ 4 IgVH Mut 1 IgVH No mut 2 IgVH Mut 42 IgVH Mut

MARCADOR SUBROGADO IgVH CRY1: Expresión en PBMC N=18 sin selección de células B Gen IgV H P (prueba de Mann Whitney) No mut (media + 2 SEM) Mut CRY1 0.380 + 0.245 0.051 + 0.038 0.007 MARCADOR SUBROGADO IgVH Ensayo Clínico

CONCLUSIONES

Los estudios funcionales y de expresión génica que hemos realizado sobre muestras de pacientes en estadíos tempranos de LLC, demuestran la heterogeneidad de esta entidad y manifiestan la existencia de subgrupos moleculares bien definidos dentro de esta patología. Mas de un centenar de genes diferencian los perfiles transcriptómicos de muestras con y sin mutaciones en el gen IgVH, en cambio no se encuentran diferencias en los perfiles de expresión con respecto a las mutaciones en BCL6. En el análisis de anotaciones funcionales, la herramienta FatiScan encuentra en las muestras con IgVH no mutado sobreexpresadas vías de señalización involucradas en supervivencia y proliferación celular provenientes del entorno y de la matriz extracelular e inhibida la apoptosis. Existen varios genes cuya expresión podría utilizarse como marcador subrogado del estado mutacional de IgVH y de pronóstico en LLC-B, siendo el gen CRY1, uno de los que proponemos para ser incorporado en ensayos clínicos y posiblemente en la práctica clínica.

Hospital Clínico Javier García Conde Ma Jose Terol Isana Benet Pilar Eroles Isabel Marugan Elena Sarsotti Miguel Marín CIPF Hematología Molecular Rosa Farras Cristina Reinoso Sandra Gallach Bioinformática Joaquín Dopazo David Montaner Hospital Arnau de Vilanova Jose Ramón Mayans Carlos García Ballesteros