Metodologías moleculares para el diagnóstico en Microbiología Bioq. María de los Angeles Sosa Catedra de Microbiología General FACENA-UNNE

ADN de doble hebra constituído por dos cadenas de nucleótidos unidos por un esqueleto de azúcar y fosfato, las cuales están- orientadas en sentido opuesto y son complementarias (A=T, G=C). La estructura de doble cadena del ADN es esencial para el proceso de replicación y garantiza que cada célula que se divide recibe copia idéntica del ADN.

Comencemos analizando la Estructura del ADN

Dogma de la Biología Molecular

Estrategias

¿En que circunstancias se recurre a métodos de biología molecular en microbiología? Patógenos intracelulares ( Virus, M.genitalium) Agentes no cultivables en condiciones de laboratorio (Pneumocystis carinii) Escasa sensibilidad diagnóstica (Aspergilosis invasora, Candidiasis diseminada) Proliferación lenta (H. capsulatum, M. tuberculosis ) Cuando se requiere de genotipificación para definir estrategias de acción terapéutica (Ej: HPV, HCV) Cuando se desea detectar genes de resistencia antimicrobiana. Poca cantidad de material. (LCR pediátricos) Alto factor de dilución (análisis de agua)

MICROORGANISMOS METODOLOGÍA VIRUS Citomegalovirus PCR / bDNA / CH/secuenciación HBV PCR / TMA / branched DNA HCV RT-PCR / RT-PCR RFLP / TMA / branched DNA HSV 1 y 2 PCR HIV RT-PCR / bDNA / NASBA / TMA /secuenciación Virus papiloma humano PCR-RFLP / CH BACTERIAS Neiseria gonorrehae PCR / TMA / LCR / CH Bordetella pertussis Chlamydia pneumoniae Chlamydia trachomatis PCR / TMA / LCR/ CH Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma hominis Ureaplasma urealyticum Mycobacterium tuberculosis PCR / TMA/ LCR Staphilococcus aureus HONGOS Aspergillus spp/Candida spp Pneumocystis carinii

Estas estrategias diagnósticas pueden ser resumidas en: Hibridación ( Southern blots, sondas moleculares, hibridación “in situ”,etc.). Amplificación de material genético del organismo patógeno (PCR, LCR, etc.)

Extraccion y purificación de ADN (Sangre, aspirados nasofaringeos, hisopados nasales, exudados, etc) Obtención de la muestra Separar las células de interés Disgregar y homogeneizar (sin romper las células!!!) ROMPER LAS CELULAS!!! - Medios hipotónicos - Sonicado - detergentes (FL) - Enzimas (Proteínas) Ahora....como separo el DNA? Fase acuosa enriquecida en ADN EXTRACCION - Sv. Orgánicos (Fenol, cloroformo, eter) PRECIPITACION - Sales (apantallan cargas) - Alcohol (dism. Cte dielectrica) RESUSPENDER ADN

Ensayos de Hibridación Ácidos Nucleicos. Southern blot. Northern blot. Western blot. Hibridación in situ (FISH) Microarray

Hibridación de ácidos nucleicos

Hibridación molecular: Desnaturalización y Renaturalización. Desnaturalización: la doble hélice de ADN se disocia en dos hebras separadas (por calor o pH ≥ 13) Renaturalización o hibridación molecular: reconstitución de la doble cadena de acuerdo al principio de complementariedad de bases nitrogenadas. Las cadenas complementarias se mantienen unidas por puentes de hidrógeno → interacciones débiles: las afecta el pH, Tº, concentración salina. Tº: al ↑ T, ↓ estabilidad del duplex (por ↑ E cinética). Tmelting: -es la T a la cual se separan el 50% de los nt. - ↑ con el % GC. Entorno químico: la presencia de iones monovalentes estabiliza la doble hélice mientas que las sustancias como la formamida o la urea desestabiliza la hélice por disrupción química de los puentes de hidrógeno.

1- Sondas de Ácidos Nucleicos. Sondas de AN: son fragmentos de ADNsc o de ARN puros y homogéneos que permiten detectar una determinada secuencia blanco en una muestra, mediante su complementariedad de bases. Marcadas radioctivamente Marcadas no radioctivamente ( Digoxigenina, avidina)

Principios Generales de los Ensayos de Hibridación.

Enzimas de Restricción

Enzimas que afectan AN Modifican AN: fosfatasas, Kinasas, metilasas, etc. Cortan AN: ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ER) son endonucleasas que reconocen secuencias de ADN bicatenario y la cortan TIPOS I II III CORTE at random fuera de sec de reconocimiento específico en sec de reconocimiento Productos heterogéneos homogéneos

Enzimas de Restricción

1-Southern Blot

2-Northern Blot.

Dos características importantes de esta técnica : Especificidad de la reacción dada por la complementariedad de la sonda. La sonda puede encontrar la secuencia complementaria en una mezcla de millones de moléculas relacionadas pero no complementarias

Hibridación de captura HPV – Chlamydia trachomatis – Neisseria

Hibridación de captura CH (Digene) Release and denature nucleic acids

Hybridize RNA probe with target DNA

Capture RNA:DNA hybrids onto a solid phase (in tube or microplate format)

React captured hybrids with multiple antibody conjugates

Detect amplified chemiluminescent signal

Métodos de Amplificación Amplificación de la secuencia diana: PCR (reacción en Cadena de la Polimerasa). Amplificación basada en la transcripción (NASBA o TMA) Amplificación dependiente de la DNA ligasa (LCR) Amplificación de la señal (bPCR)

PCR Amplificar una secuencia en forma exponencial. Luego de 35 ciclos, a partir de una copia se puede obtener 236 copias de un fragmento de DNA —68 mil millones de copias. Comenzando con 100 copias se puede obtener 3.73 ug de DNA, a partir del cual se puede visualizar en geles, clonar en vectores particulares, secuenciar, etc.

PCR Mezcla de Reacción Par de“primers” específicos ADN Polimerasa termoestable ADN templado Buffer p/ ADN Pol. MgCl2 dH2O estéril dCTP Desoxinucleótidos dATP PCR Mezcla de Reacción dTTP dGTP

PCR: Ciclador térmico

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

PCR: pasos de la reacción desnaturalización Separar las hebras molde para la síntesis de nuevas hebras

PCR annealing “aparear” primers a la hebra molde para dirigir la síntesis de DNA La síntesis de DNA requiere de primers para comenzar

PCR Extensión Adición de nucleótidos, uno a la vez, para extender la hebra de DNA (extremo 3’) utilizando a la hebra madre como molde

PCR animation

PCR

CORRIDA ELECTROFORETICA PREPARADO DEL GEL SIEMBRA DE LA MUESTRA CORRIDA ELECTROFORETICA Muestra Buffer de siembra (ej: ABF) densidad marca frente de corrida Agarosa Buffer de corrida (ej:TBE)

PCR Corridas en gel de Agarosa

Variantes de PCR Simplex Nested PCR. Multiplex. PCR real time

PCR Simple de Chlamydia tracomatis Amplificación de una secuencia del gen que codifica para el ARNr 16S Amplificación de una secuencia del plásmido críptico de C. trachomatis. 10 a 100 veces mas sensibles que la primera.

a. PCR - Ct Muestra: endocervical o uretral / PBS. Neonatos: Secreción conjuntival o aspirados nasofaríngeos. Extracción y purificación de ADN: Proteinasa K / Fenol-cloroformo. PCR : Primers plásmido Ct específicos : KL1, KL2 C. trachomatis: 241 pb

Métodos moleculares Ventajas Método “Gold standart” para C. trachomatis Se independizan del transporte. Alta sensibilidad y especificidad Se pueden utilizar sondas simultáneas para N.gonorrheae y C. trachomatis. Se puede utilizar en muestras no invasivas ( orina)

b. PCR anidada (nested PCR) 1º Ronda de PCR 2º Ronda de PCR (primers internos al producto de la primer PCR) Ventajas: Aumento de la sensibilidad: Se detectan cantidades de ADN muy inferiores a las que se detectan con una PCR normal. Aumento de la especificidad: Al utilizar otros 2 cebadores internos se aumenta la posibilidad de amplificar sólo un tipo de molécula.  Desventaja: Muy sensible a las contaminaciones.

DR--------

Diagnóstico de laboratorio de las infecciones por Mycobacterium tuberculosis - Microscopía Baciloscopía directa - ZN Búsqueda de BAAR Cultivo Medios sólidos: Loewenstein - Jensen Medios líquidos: Bactec - MB Check Diagnóstico genético-molecular DNA probes (Identificación en combinación con Bactec) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Importancia del diagnóstico por PCR del Mycobacterium tuberculosis

c. PCR Multiplex Se realiza cuando en el análisis  es util amplificar varias regiones de un mismo gen o de distintos genes a la vez. En lugar de utilizar una única pareja de cebadores, se utilizan varias parejas, cada una de las cuales amplifica una región diferente. (Ej: E. coli O:157 H: 7)

PCR Múltiple stx1 / stx2 / rfbO157 PRIMER SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5’-3’) UBICACION DENTRO DEL GEN TAMAÑO stx1a GAAGAGTCCGTGGGATTACG 1191-1210 130 stx1b AGCGATGCAGCTATTAATAA 1301-1320   stx2a TTAACCACACCCCACCGGGCAGT 426-445 346 stx2b GCTCTGGATGCATCTCTGGT 752-771   O157F CGGACATCCATGTGATATGG 393-413 259 O157R TTGCCTATGTACAGCTAATCC 632-652   346 bp 259 bp 130 bp  Leotta y col. Rev. Arg. Microbiol. 37:1-10, 2005

PCR Factor eae PRIMER SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5’-3’) TAMAÑO FRAGMENTO pb SK1 CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC 864 SK2 CCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG Referencia Karch H., Bohm H., Schmidt H, Gunzer F., Aleksic S., Heesemann J. Clonal structure and pathogenicity of Shiga-like toxin-producing, sorbitol-fermenting Escherichia coli O157:H-. J. Clin. Microbiol. 1993; 31: 1200-5.

HIV

PCR Múltiple HIV- diagnóstico Beta actina env gag

HIV- CARGA VIRAL B- DNA : CHIRON RT- PCR : AMPLICOR MONITOR ROCHE NUCLISENS-NASBA : ORGANON-BIO MERIEUX COBAS TAQMAN HIV 1 : REAL TIME PCR EASY Q HIV 1 : REAL TIME NASBA

5-PCR en tiempo real Permite cuantificar, aumento de especificidad y de sensibilidad Basado en la detección y cuantificación de un reporter fluorescente. Se mide emisión de fluorescencia en cada ciclo de la PCR.

Sistemas de reporteros fluorescentes: Se intercala en el DNA doble cadena. No emite fluorescencia cuando se encuentra en solución, pero sí cuando se encuentra unido al DNA. Se mido la fluorescencia al final de cada ciclo (luego de la extensión) VENTAJA: - Es el más barato. DESVENTAJA: No es específico, si hay amplificación de bandas inespecíficas también va a dar señal. No sirve para PCR multiplex Syber Green

Molecular beacons Sonda que hibrida específicamente entre los dos primers. 5’ Fluorescencia 3’ Quencher (apagador) FRET: (Fluorescent Resonance Energy Transfer) el fluoróforo cuando se encuentra cercano al quencher no fluoresce ya que le transfiere su energía. La sonda libre en solución toma una estructura de orquilla y no produce fluorescencia Cuando hibridiza con el DNA molde se separa el Fluoróforo y el quencher permitiendo la Fluorescencia.

Sondas Taqman La sonda intacta presenta un efecto FRET. La actividad 5’ exonucleasa de la polimerasa degrada la sonda Taqman en la extención. Se separa el fluoróforo del quencher emitiendo Fluorescencia que se incrementa en cada ciclo proporcionalmente a la sonda degradada.

Epidemiología microbiana RFLP Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción.(Candida) AFLP Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción.(HPV) Microarrays o chips de DNA Secuenciación

Polimorfismo de Largo de Fragmentos de Restricción: RFLP Extraccion de ADN genómico. Corte con enzimas de restricción. Electroforesis en gel de agarosa. Aislamientos de C. albicans, restricción con Eco R1, hibridización con sonda 27A

Producto de amplificación Amplificación por PCR y análisis de longitud de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP o AFLP) Muestra HPV Extracción de DNA DNA PCR PCR Restricción enzimática Enzimas de restricción Producto de amplificación Fragmentos de restricción GENOTIPIF.

CLASIFICACION DE LOS HPV EN BASE A SU POTENCIAL ONCOGÉNICO Tipos virales mucosotropos: HPVs de bajo riesgo: 6,11,40,42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 HPVs de alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82 (Muñoz et al, N Engl J Med 2003)

Genotipificación HPV

RAPD: Random Amplification of Polymorphic DNA Amplificación por PCR utilizando un solo primer de secuencia arbitraria. Un primer adecuado genera un patrón de bandas distintivo para una determinada especie o una determinada cepa.

Análisis de Aislamientos de C Análisis de Aislamientos de C. neoformans Provenientes de Distintas Regiones Geográficas de Sud América PCR con el primer (GACA)4 Distancia de Ligamiento Argentina Paraguay Brasil Esta Técnica permitió identificar genotipos asociados a regiones específicas

Secuenciación de ADN

Ej. aplicaciones en infectología: Determinación de resistencia de la transcriptasa reversa y proteasa a antivirales en pacientes HIV+; resistencia a ganciclovir en CMV y resistencia a rifampicina en Mycobacterium tuberculosis.

DNA CHIP MICROARREGLOS DE DNA

MICROARREGLOS Diamètre 100µM

Conclusiones

PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa. Ventajas: -Es rápida (3-5 minutos por ciclo) y fácil de implementar en manos capacitadas. -Sensible. -Es robusta. -Permite numerosas aplicaciones. Desventajas: -Se necesita cierta información de la secuencia en estudio para poder diseñar los primers. -Limitaciones del tamaño del fragmento a amplificar -Errores de la replicación. -Contaminación (se reduce considerablemente tomando las precauciones necesarias y en manos experimentadas).

Errores en la PCR Amplicón del tamaño incorrecto - problemas en el diseño del primer - Problemas en el apareamiento del primer/Baja temperatura de annealing - Secuencias redundantes Ausencia de producto de amplificación no se produce apareamiento con los primers Muy alta temperatura de annealing temperature - primer dimeros Mucha cantidad de molde No inclusión de la enzyme en la mix de dNTPs mucho/poco MgCl2 Productos PCR con errores mucho/poco MgCl afecta correcciones de la polymerase Baja fidelidad de la enzyme Taq polymerase vs Pfu

Con esta técnica, prácticamente cualquier segmento de ADN de una determinada bacteria, hongo o virus puede ser amplificado y detectado. Sin embargo, los laboratorios deben analizar varios factores, entre los cuales destaca la aplicación clínica que podría tener la detección de un determinado organismo, así como los costos, sensibilidad y especificidad del examen en comparación con las técnicas tradicionales. En general, las técnicas de diagnóstico molecular están indicadas cuando un organismo no puede ser cultivado in vitro, o cuando requiere de un medio complejo y largos períodos de incubación.

Interpretación Debido a la alta sensibilidad de estos exámenes, la interpretación es en algunos casos díficil, ya que el organismo puede no estar viable pero su ADN puede todavía ser amplificado. Además, la presencia de un organismo en una determinada muestra no siempre significa infección. Es por ello que para el caso de infecciones virales (VIH y CMV) se recomienda realizar la determinación de la carga viral, la cual determina la cantidad de secuencias blanco presentes en el plasma de un individuo.

Falsos positivos debido a contaminación. Falsa positividad debido a la contaminación con ácidos nucleicos, que puede provenir de tres frecuentes: - de contaminación entre muestras -otras muestras clínicas que contienen un número elevado se secuencias blanco- de la contaminación de reactivos, por amplificaciones anteriores de la acumulación de productos de PCR (amplicones) en el laboratorio por amplificaciones sucesivas de la misma frecuencia. Por estas razones, los laboratorios que usan técnicas de amplificación deben tener normas estrictas de control de calidad. En nuestro país no existen regulaciones formales, pero los laboratorios debieran tratar de cumplir el mínimo de requerimientos, como es tener un espacio separado para el procesamiento de la muestra y otro para la amplificación y tener además el personal adecuado para realizar estas técnicas.

Muchas Gracias