Marcadores Moleculares Luis Destefano Beltrán Departamento de Ciencias Biológicas y Fisiológicas Universidad Peruana Cayetano Heredia

Marcadores Moleculares Un gen o secuencia de ADN que se puede usar para identificar a un organismo, a una especie, a una cepa o a una característica fenotípica asociada con él Un señal usada en el aislamiento de genes eucarióticos: una sonda de RFLP o un lugar de unión de partidor para amplificación Secuencias de ADN que pueden ser identificadas mediante un simple ensayo: tan pequeño como un SNP o o un frag. de ADN generado por ER’s.

Marcadores moleculares son segmentos o fragmentos de cromosoma que no codifican necesariamente alguna característica, que no están afectados por el ambiente. pero que son heredados de una manera Mendeliana (2006). Marcadores Moleculares

Isozimas y Alozimas El “abuelo” de los marcadores moleculares El “abuelo” de los marcadores moleculares Lewontin y Hubby, 1966 Lewontin y Hubby, Substituciones de amino acidos cambian - Substituciones de amino acidos cambian la movilidad de la enzima en el gel: -plegamiento y/o carga la movilidad de la enzima en el gel: -plegamiento y/o carga Aún en uso en estudios de Genética de Aún en uso en estudios de Genética de Poblaciones que necesitan identificar Poblaciones que necesitan identificar bajos niveles de variación genética. bajos niveles de variación genética.

Isozimas Pros: Pros: Protocolos bien desarrollados con moderado grado de dificultad. No se necesita informacion genómica. Existen décadas y décadas de datos acumulados (“mining”). (“mining”). Cons:Cons: Poca variación. Se necesita abundante tejido fresco. Loci son una muestra no aleatoria del genoma y muchos estan bajo fuerte selección. Puede ser considerado un “arte”. Muchos reactivos químicos peligrosos.

Marcadores Moleculares

Southern blots Aislamiento del ADNAislamiento del ADN Digestión del ADN con enzima de restricciónDigestión del ADN con enzima de restricción Separación de los fragmentos de ADN de acuerdo a su tamañoSeparación de los fragmentos de ADN de acuerdo a su tamaño Denaturación del ADNDenaturación del ADN Transferencia de las cadenas simples de ADN a la membranaTransferencia de las cadenas simples de ADN a la membrana

Metodología Preparación de la sondaPreparación de la sonda –Marcación –Denaturación Hibridación de la sonda a la membranaHibridación de la sonda a la membrana Enjuague de la membranaEnjuague de la membrana AutoradiografíaAutoradiografía

sonda ubicación de los sitios de restricción

ADNAnemiaFalciforme ADNAnemiaFalciforme ADNNormal ADNNormal AB A + B A B 1. Cortar con MstI MstI 2. Gel 1. Cortar con MstI MstI 2. Gel ADN β-Globina Normal ADN Anemia Falciforme Hibrididación Southern Electroforesis en geles de Agarosa

Southern Blot

Desventajas Es tediosa y trabajosaEs tediosa y trabajosa Puede durar varios díasPuede durar varios días CostosaCostosa Usa radioisótoposUsa radioisótopos

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

“PCR is the practice of Biology without a permit”

“RAPD allows analysis without a clue”

Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) 1990, Welsh & McCleland and Williams et al. 1990, Welsh & McCleland and Williams et al. Usa partidores muy cortos (10 pb) para amplificar Usa partidores muy cortos (10 pb) para amplificar fragmentos aleatorios de ADN. fragmentos aleatorios de ADN. No se necesita ninguna información acerca del No se necesita ninguna información acerca del genoma en estudio genoma en estudio Marcador dominante: presente o ausente Marcador dominante: presente o ausente Muy desacreditado, pero probablemente no es tan Muy desacreditado, pero probablemente no es tan malo como algunos podrían pensar malo como algunos podrían pensar

Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Amplified Fragment Length Polymorphism

AFLPs Pros: -Muchos loci estudiados al mismo tiempo -No se necesita ninguna información anterior -Alta variabilidad Cons: -Homoplasia en el tamaño de los frag’s -Problemas con reproducibilidad -Protocolo es muy largo -Marcador dominante anónimo -Demasiados loci…..!!

ADN Repetitivo Microsatélites o Secuencias Simples Repetidas (Simple Sequence Repeats, SSRs) - Mono-, di-, tri-, y tetra-nucleótidos Minisatélites o Short Tandem Repeats (STRs) bp Variable Number of Tandem Repeats bp

Microsatélites

Rearreglos en los tándem repetidos debido a un crossover desigual

Microsatélites Pros:Pros: -Altamente variable -Muchos alelos por locus -Marcador co-dominante Cons:Cons: - Dinámica evolutiva desconocida - “Stutter y alelos nulos complican el “scoring” el “scoring” -Alta inversión inicial para desarrollar loci

Single Nucleotide Polymorphism: SNPs Pueden representar hasta 90% de la VariaciónPueden representar hasta 90% de la Variación Genética Humana 1.5 millon de posiciones presentan variabilidad1.5 millon de posiciones presentan variabilidad Puede ser la base de la susceptibilidad aPuede ser la base de la susceptibilidad a enfermedades comunes (cáncer, diabetes, etc) Farmacogenética: busca identificar la posibleFarmacogenética: busca identificar la posible respuesta a las terapias con drogas. Metodos para identificar depende si es un SNPMetodos para identificar depende si es un SNP desconocido o conocido

Marcadores No Polimórficos STSs (Sequence Tagged Sites)STSs (Sequence Tagged Sites) Secuencia corta de ADN (200 – 500 bp) con una ubicación cromosómica conocida que ocurre una vez en el genoma. Secuencia corta de ADN (200 – 500 bp) con una ubicación cromosómica conocida que ocurre una vez en el genoma. ESTs (Expressed Sequence Tags)ESTs (Expressed Sequence Tags) STSs derived from ADNc’s STSs derived from ADNc’s

Conclusiones Todos los MM’s no son iguales. Ninguno de ellos son ideales. Algunos son mejores para algunos propósitos que otros. Sin embargo, todos son preferibles a los M’s Morfológicos para propósitos de mapeo