Contaje de placa aeróbica, Tinción Gram y Aislamiento Laboratorio de Microbiología de Alimentos

Contaje de placa aeróbica Provee un estimado general de bacterias aeróbicas vivas Evalúa calidad Predictor de “shelf-life” Monitoreo ambiental Excluye Anaerobos obligados Microaerofílicos

Contaje en placas Asume Cada colonia proviene de una sola célula bacterial Algunas colonias puede ser originadas de una “agrupamiento”de bacterias • Se reporta como - Unidad formadora de colonias (CFU)/gramo ó ml. - NO como bacterias totales

Resultados del Contaje de placa aeróbica Evalúa la sanitación de una producto Predice la durabilidad (Shelf-life) Indicador de seguridad (Safety) Monitorea el ambiente

Limitaciones del contaje de placa aeróbica Sólo se consideran organismos aeróbicos No se sabe el tipo de bacteria El medio de cultivo permite el crecimiento de ciertas bacterias Limitaciones visuales/Errores humanos Difícil de distinguir entre partículas de alimentos y bacterias No se debe utilizar en alimentos fermentados Las colonias podrían ser muy pequenas para verse

Tipos de muestra Sólidas Hisopo Ambientales y de envases Líquidas Líquidos no viscosos se miden con pipetas Líquidos viscosos se pesan Sólidas Pesar asépticamente Hisopo Tomar muestra pasando un hisopo por un área definida Ambientales y de envases Enjuage el interior del envase Abra una placa para tomar una muestra del aire Placas RODAC

Protocolo para Contaje en Placas Prepare un homogenado de la muestra Dilución 1:10 1 parte de la muestra a 10 partes del volumen total Mezcle en licuadora o “stomacher”por 2 minutos 10 g/ml muestra 90 ml of diluyente 1:10 Dilución – 10-1

Protocolo para contaje en placas Prepare diluciones seriadas Diluya hasta que obtenga colonias separadas entre 20-200 en una placa Utilice una pipeta estéril entre cada dilución Ponga la pipeta usada en el área designada Mezcle cada botella de dilución 25 veces en un arco de 90 grados por 7 segundos Use amortiguador de fosfato o peptona para diluir

Diluciones 10-2 10-3 10-4 10-5 10-1 (1:100) (1:1000) (1:100000) (1:10) Sample Homogenate Dilution Blanks Containing 90 ml Diluent 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10-2 10-3 10-4 10-5 10-1 (1:100) (1:1000) (1:100000) (1:10) (1:10000)

Placas Put 1 ml of Each Dilution into Empty Petri-Dish 10-2 10-3 10-4 10-5 10-1 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Protocolo Contaje de placas Anada 18-20 ml de agar (45-50F), a la placa petri El agar no puede estar muy caliente porque mata las bacterias Método estándar ó agar de placa (Plate Count Agar) Mueve 10x en cada dirección Deje que solidifique Incube las placas invertidas a 35-37 por 48 horas.

Esterilización El equipo y el medio de cultivo debe estar estéril Esterilización en aire caliente 170 C por una hora Ponga en horno por 2 horas luego que éste alcance la temperatura Envuelva en papel o papel de aluminio Esterilización por vapor 121C por 15 min. Debe alcanzar el autoclave 15 psi de presión Equipo y medio líquido No ponga las tapas apretadas

Tinción Gram Gram positivo ó negativo Basado en la estructura de la pared Gram positivo Pared gruesa por la capa de peptidoglicano Gram negativo Capa fina con presencia del lipopolisacárido

Obtención de colonias aisladas La meta es obtener colonias aisladas del alimentos y/o cultivo Las colonias pueden ser identificadas y evaluadas Collect loopful of culture Streak in each area starting with area 1 Flame Loop in between areas 2 1 3 4

Contaje de placas Sólo cuente las placas que tengan entre 20 y 200 colonias Más de 200 TNTC Menos de 20 TFTC

Contaje de placas - 175 10 150 TNTC 2 192 200 1 TNTC1 Average 1:100000 Plate 1 Too Numerous to Count 2 Too Few to Count Average two countable plates and Multiply by Dilution Factor Count is 175 x 104 Must Convert to TWO Significant Digits 1.8 x 106 cfu/ml or g

Contaje-Ejemplos TFTC 125 250 - Average 20 100 200 TNTC 2 10 150 300 1 10-4 10-3 10-2 10-1 Plate Use ALL FOUR even though 300 is outside range. If ONE PLATE is in RANGE, use BOTH for Average. 250 x 102 – 2.5 x 104 125 x 103 – 1.3 x 105 AVERAGE – 7.8 x 104 cfu/g or ml

Contaje - Ejemplos 350 - Average 400 TNTC 2 300 1 10-4 10-3 10-2 10-1 Plate All Dilutions are outside Range so we MUST use counts Outside range 350 x 104 – 3.5 x 106 cfu/ml or g* Use an “*” when using dilutions outside countable ranges This means it is an ESTIMATED count

Contaje- Ejemplos 125 250 - Average 5 400 TNTC 2 10 300 1 10-3 10-2 10-1 Plate If Both Dilutions are outside Range, use the Higher Dilution (LOWER COUNTS) 7.5 x 103 cfu/ml or g*

Placas con muchas colonias Cuente la dilución mayor y utilice las rejillas en el contador de colonias 1 rejilla = 1 cm2 Una placa plástica estándar tiene 56 cm2 de área de superficie Si <10 colonias/cm2 cuente 12 cuadrados (6 consecutivos verticales y 6 consecutivo horizontales) Totalice y divida por 12 (promedio). Multiplique por 56 para obtener el número total de colonias en la placa. Reporte como estimado Si >10 colonias/ cm2 Cuente 4 cuadrados, promedie y multiplique por 56

Variaciones al contaje aérobico Psicotróficos Incube a 5-7 C por 10 días Use esparcido Termodúricos Ponga 5 ml de la muestra o la dilución 1:10 de la muestra sólida en bano de agua entre 60-80n C por 30 minutos Enfríe en hielo por 10 minutos Ponga en placa e incube

Primer Período

Esquema

Segundo Período

Petrifilms

Ventajas y desventajas de utilizar los petrifilms Rápido Menos espacio Fáciles No hay que preparar medio Distinción entre CFU vs. Partículas de alimentos Desventajas Morfología de la colonia Costoso Difícil de leer