Separación de células por centrifugación

Centrifugación isopícnica (en un gradiente de densidad)

Formación de un gradiente discontinuo

Formador de gradientes continuos

Gradiente formado durante la centrifugación Gradiente de Percoll 20.000  g , 1 hora Gradiente formado durante la centrifugación

Centrifugación isopícnica Fibroblastos MR-5 Células Hela Centrifugación isopícnica

Recuperación de las células Células Hela Fibroblastos MR-5 Recuperación de las células

Separación por elutriación

La centrifugadora

La cámara de separación

La separación por elutriación A) Una población mixta de células entra en la cámara de separación con una velocidad de flujo y una velocidad de centrifugación determinadas B) Se aumenta la velocidad de flujo (o se reduce la velocidad de rotación) para que los distintos tipos de célula se vayan separando. Las células más pequeñas se colocan en el frente de elutriación. C) Se vuelve a aumentar la velocidad de flujo (o a reducir la velocidad de rotación) para que las células más pequeñas salgan de la cámara y se puedan recoger. La separación por elutriación

Separación de células mediante campos magnéticos

Dynabeads® (Invitrogen)

Las Dynabeads® se pueden conjugar con diversos ligandos

Dynabeads® (Invitrogen) Pincha en el recuadro para ver el vídeo

Separación de células con Dynabeads® (Invitrogen) El protocolo de separación puede constar de un solo paso o de varios. La selección puede ser positiva (se unen a lo que me interesa) o negativa (se unen a lo que no me interesa). Hay protocolos que usan los dos tipos de selección. Separación de células con Dynabeads® (Invitrogen)

El imán atrae a las esferas magnéticas (y las células adheridas a ellas, que se quedan inmovilizadas en la pared del tubo) Las células que no me interesan se unen a anticuerpos específicos unidos a esferas magnéticas (se trata de una selección negativa) Las células que me interesan (y otras) quedan en suspensión listas para ser separadas mediante citometría de flujo Separación negativa

MACS® (magnetic cell sorting) CD8+ T cells Microbeads MACS® (magnetic cell sorting)

MACS® microbeads

Columnas Columnas MACS®

Separación positiva

MACS® columns

Separación en un campo magnético: MACS® (Miltenyi)

Citometría de flujo

Citometría de flujo

Citometría de flujo: Aplicaciones

Componentes de un citómetro de flujo

El punto de interrogación El punto de interrogación es el núcleo del sistema. Allí es donde el láser incide en la muestra y el sistema óptico recoge la luz difractada y la fluorescencia. El punto de interrogación

Enfoque hidrodinámico Las células fluyen por un conducto central que está rodeado por otro conducto de mayor diámetro que transporta una disolución salina a mayor velocidad. En el punto de encuentro, el fluido envolvente arrastra a las células que van llegando por el conducto interno, que se hace más estrecho en su extremo El resultado final es que se crea una hilera de células que atravesarán el láser de una en una. Enfoque hidrodinámico

Difracción a bajo ángulo La difracción frontal (o difracción de bajo ángulo) es la luz difractada hacia delante. Su intensidad es directamente proporcional al tamaño de la célula. Cuando el láser incide en la célula, ésta difracta la luz en todas direcciones Difracción a bajo ángulo

Detección de la difracción a bajo ángulo Delante del detector hay una barra que evita que la intensa luz del láser incida directamente sobre él. La luz difractada se cuantifica mediante un detector que convierte la intensidad en voltaje Detección de la difracción a bajo ángulo

La luz que llega al detector se convierte en un impulso de tensión La magnitud del impulso es proporcional al tamaño de la célula. Recogida de datos de difracción a bajo ángulo

Recogida de datos de difracción a bajo ángulo La magnitud del impulso es proporcional al tamaño de la célula. Recogida de datos de difracción a bajo ángulo

Histograma de la difracción a bajo ángulo El histograma indica el número de células que presenta la propiedad física seleccionada o que expresa el marcador molecular de interés Histograma de la difracción a bajo ángulo

Umbral de detección de tamaños Si no se aplica un umbral, la señal mayoritaria corresponde a residuos celulares, bacterias o células pequeñas Aplicado un umbral, sólo se detectan las señales que superan un valor determinado Umbral de detección de tamaños

Difracción a ángulos elevados La difracción lateral (o difracción de ángulo elevado) es la luz difractada hacia los lados. La difracción lateral es provocada por los gránulos y depende de la complejidad interna de la célula. Difracción a ángulos elevados

Detección de la difracción a ángulos elevados La difracción lateral se mide en un detector colocado perpendicularmente (a 90º) a la trayectoria del láser . Detección de la difracción a ángulos elevados

Histograma de la difracción a ángulo elevado

Resultados combinados de la difracción La difracción frontal (en función del tamaño) parece indicar que sólo hay una población de células. La difracción lateral (en función de la complejidad) indica que hay tres tipos de células. Resultados combinados de la difracción

Análisis bidimensional de la difracción Este histograma refleja dos parámetros. En el eje X se representa la difracción a bajo ángulo y en el eje Y la difracción a ángulos elevados. El número de células es proporcional a la densidad de puntos. Análisis bidimensional de la difracción

Análisis multiparamétrico de la difracción

Otro ejemplo

El fenómeno de la fluorescencia

Marcaje de células con anticuerpos fluorescentes Emission light Marcaje de células con anticuerpos fluorescentes

Detección de la fluorescencia La fluorescencia se mide mediante detectores colocados perpendicularmente (a 90º) a la trayectoria del láser Mediante un sistema de filtros y espejos se dirige la señal de fluorescencia hasta los detectores (se pueden medir 3 ó 4 señales distintas en un mismo experimento) Detección de la fluorescencia

Experimento con fluorescencia (1 color) Cuando la célula marcada atraviesa el láser, se genera una señal de fluorescencia que llega al detector y se convierte en un pulso de tensión proporcional a la magnitud de la señal. Experimento con fluorescencia (1 color)

Histograma de la fluorescencia (1 color)

Experimento con fluorescencia (2 colores)

Longitudes de onda de excitación y emisión La excitación de los dos fluoróforos se lleva a cabo con láser de una longitud de onda de 480 nm Cada fluoróforo emite fluorescencia con una longitud de onda distinta: Alexa emite a 520 nm y la Ficoeritrina emite a 580 nm Longitudes de onda de excitación y emisión

Diversas poblaciones de células

FACS (Fluorescence-activated cell sorter)

Clasificación de las células La gota se carga según el tipo de fluorescencia que tenga la célula. La carga (positiva, negativa o nula) determina a qué tubo se dirige la célula. La gota que contiene una célula se aproxima al punto de interrogación Clasificación de las células

Clasificación de células del sistema inmunitario

Clasificación de células activada por fluorescencia (FACS)

Las etapas de la FACS 1.- Cada célula es analizada por el láser 2.- La boquilla vibradora crea gotas al final del tubo. En cada gota hay una sola célula. 3.- A cada gota se le asigna un tipo de carga, en función de la fluorescencia de la célula que contiene. 4.- Las placas deflectoras atraen o repelen a las células, que son recogidas en distintos tubos según su carga (positiva o negativa, mayor o menor). 5.- Se analizan las células recogidas para comprobar que la selección ha sido correcta. 6.- Las células recogidas se pueden cultivar para obtener un mayor número de ellas. Las etapas de la FACS