Transformación Ingreso a la célula de DNA presente en el medio Bacterias Levaduras Células de animales (mamíferos) Células vegetales

Bacterias (Escherichia coli) Plásmidos → elementos extracromosómicos de replicación autónoma Plásmidos manipulados por ingeniería genética: vectores de clonamiento ►Origen de replicación ►Gen de resistencia a antibiótico (marcador de transformación) ►Sitio de clonamiento (“polylinker”) Transformación (transfección) llevada a cabo por: Permeabilización con CaCl2, choque de temperatura Electroporación Utilidad ►Biblioteca de cDNA - sitio de clonamiento asociado a gen de -galactosidasa ►Expresión de proteínas recombinantes - sitio de clonamiento asociado a operón lac (expresión inducible por IPTG) y elemento que facilite purificación (ej. His-tag)

Colonias azules : fragmento clonado Colonias blancas : sin fragmento X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) -galactosidasa H HO Producto azúl galactosa Colonias azules : fragmento clonado Colonias blancas : sin fragmento - IPTG → expresión bloqueada + IPTG → expresión

Levaduras (Saccharomyces cerevisiae) Plásmidos → del tipo lanzadera (“shuttle”) ► Origen de replicación en E. coli ► Gen de resistencia a antibiótico (selección en E.coli) ► Origen de replicación en levadura ● 2  ● ARS (secuencia de replicación autónoma) ► Marcador de selección metabólico YACs → Cromosomas artificiales de levadura ► Secuencias teloméricas ► Secuencias centroméricas ► ARS (secuencia de replicación autónoma)

Vectores y marcadores de selección en levaduras (YAC)

otros organismos Transformación llevada a cabo por: 1. Generación de esferoplastos, permeabilización con CaCl2, choque de temperatura 2. Tratamiento con acetato de litio y PEG, choque de temperatura Utilidad ► Expresión de proteínas recombinantes que no se pliegan correctamente en E. coli ► Clonamiento de fragmentos muy grandes para el estudio de genomas complejos (YACs) ► Genes de levadura → similitud con genes de animales y plantas superiores Levadura útil como modelo para probar función de genes de otros organismos

Manipulación de genes por recombinación homóloga

Eliminación (KO) de genes cromosómicos

“Plasmid shuffle” Estudio de función de genes KO TPK1, TPK2, TPK3 “Plasmid shuffle” Estudio de función de genes mutantes o genes foráneos

Interacción de proteínas por ensayo de doble híbrido

Animales Genes en: ► Fragmentos de DNA ► Vectores tipo plásmido con elementos virales ► Virus Fragmentos y vectores que no se replican → Transitoria Permanente (integración) Vectores que se replican y virus → Genomas extracromosómicos independientes Partículas virales

Transformación llevada a cabo por: Microinyección DNA precipitado con fosfato de calcio (endocitosis) Electroporación Liposomas Infección viral Utilidad ► Expresión de proteínas recombinantes ► Estudio de la expresión de genes en entorno natural (promotor + gen reportero) ► Estudio de la función de los genes en entorno natural ● Expresión ● Silenciamiento (antisentido)

Marcadores de selección

Ejemplo 1: Transformación con fragmentos de DNA

Ejemplo 2: Transformación con vectores

Localización de HBZ-GFP y HBZ-SI-GFP en células COS7 Murata et al. J. Virol. 80(5): 2495-2505 (2006) Vector: pcDNA3/HBZ-GFP pcDNA3/HBX-SI-GFP

Ejemplo 3: Transformación combinada fragmentos de DNA y virus

Ejemplo 4: Transformación combinada fragmentos de DNA y virus

Ejemplo 5: Transformación con virus (retrovirus)