LA INGENIERÍA GENÉTICA y sus aplicaciones.

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1 LA INGENIERÍA GENÉTICA y sus aplicaciones.

2 ÍNDICE Introducción. Conceptos frecuentes en ingeniería genética.
Clonación de un gen. Aplicaciones de la ingeniería genética (biotecnología). Ingeniería genética y bioética.

3 1. Introducción Biotecnología: utilización de los seres vivos o sus componentes para realizar determinados procesos químicos con fines industriales. Biotecnología clásica: uso de microorganismos no manipulados genéticamente. (tal cual se encuentran en la naturaleza) Biotecnología moderna basada en aplicaciones de la ingeniería genética: organismos manipulados genéticamente. “La ingeniería es el arte de aplicar los conocimientos científicos a la invención, perfeccionamiento y utilización de la técnica industrial en todas sus dimensiones” Ingeniería genética: conjunto de procedimientos que permiten modificar artificialmente el genoma de los seres vivos / alteración, intencionada, del genoma de un ser vivo. aislar, modificar, replicar y expresar el material genético Tecnología del ADN recombinante: métodos y técnicas que se aplican en IG

4 2. Conceptos frecuentes en ingeniería genética.
ADN recombinante: es una molécula de ADN formada por la unión artificial de ADN proveniente de dos organismos diferentes. Clon: copia idéntica. - de una molécula - de una célula - de un organismo Organismo transgénico: incorporan en su genoma de forma estable ADN procedente de otras especies. O.G.M. (GMO): organismo genéticamente modificado. Secuenciación: técnica que permite conocer la secuencia de bases del ADN (o de aa de una proteína...) PCR: reacción en cadena de la polimerasa. Técnica que permite aumentar el nº de copias de un fragmento de ADN. Vectores: elementos genéticos que sirven para introducir genes extraños en células hospedadoras. Enzimas de restricción: enzimas endonucleasas que cortan el ADN en puntos concretos (secuencias específicas). Célula transformada: célula que contiene y expresa ADN foráneo.

5 3. Clonación de un gen 3.1. Aislamiento y obtención del gen.
3.2. Selección del vector de clonación. 3.3. Formación del ADN recombinante. 3.4. Inclusión del ADNr en una célula hospedadora. 3.5. Detección del gen clonado. 3.6. Multiplicación de las células que contienen el gen clonado.

6 3.1. Aislamiento y obtención del gen:
3. Clonación de un gen 3.1. Aislamiento y obtención del gen: A ) Proc: corte del ADN cromosómico con ER para obtener el gen o genes. selección del gen a partir de una genoteca Enzimas de restricción = Tijeras moleculares Euc: síntesis a partir de ARNm ADN sintético Biblioteca de ADNc

7 3.1. Aislamiento y obtención del gen:
3. Clonación de un gen 3.1. Aislamiento y obtención del gen: Análisis de los fragmentos obtenidos. Los fragmentos obtenidos se pueden separar por tamaños mediante la técnica de electroforesis Los fragmentos se desplazan en relación inversa con su tamaño, los fragmentos más pequeños se mueven rápidamente, mientras que los grandes lo hacen muy lentamente.

8 3.2. Selección del vector de clonación.
3. Clonación de un gen 3.2. Selección del vector de clonación. Vector de clonación: pequeña molécula de ADN en la que se inserta el gen que queremos clonar que tienen capacidad para replicarse dentro de las células hospedadoras de forma independiente (“vehículo del gen”). Selección del vector:(tamaño y características del gen). Tipos de vectores: Plásmidos 2. Bacteriófagos. 3. Cósmidos. 4. YACs (cromosomas artificiales de levadura). 5. Genomas de los virus modificados.

9 Marcadores 3. Clonación de un gen
Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar : Genes de resistencia a antibióticos. (bacterias crecen en medios con el al antibiótico) Genes de luminiscencia. (la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz). Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.

10 3.3. Formación del ADN recombinante
3. Clonación de un gen 3.3. Formación del ADN recombinante Gen que queremos clonar + Vector = ADN recombinante CORTADO CON E.R. CORTADO CON E.R. ENZIMAS: ADN LIGASAS

11 3. Clonación de un gen INSERCIÓN DEL GEN EN VECTORES DE CLONACIÓN
- ADN circular - tamaño menor que el del cromosoma. - origen de replicación PLÁSMIDOS

12 Se inserta el gen deseado en un fragmento de ADN vírico.
3. Clonación de un gen INSERCIÓN DEL GEN EN VECTORES DE CLONACIÓN A Bacteriófagos (Ej. Fago lambda, fago M13) Se inserta el gen deseado en un fragmento de ADN vírico. Posteriormente se ensamblarán las distintas partes del virus. Así quedará el virus completo. En el siguiente paso se insertará este ADN por el proceso de la TRANSDUCCIÓN. B C

13 Cósmidos 3. Clonación de un gen
INSERCIÓN DEL GEN EN VECTORES DE CLONACIÓN Cósmidos Son plásmidos que contienen el fragmento de ADN deseado que posee un extremo cos (borde cohesivo procedente del genoma del fago lambda) y se empaqueta en el interior de un fago. Se construye el cósmido uniendo los tres elementos génicos, y el resultado final es poder introducir en la célula receptora fragmentos largos de ADN.

14 3. 4. Introducción del ADNrec en la célula hospedadora
3. Clonación de un gen 3. 4. Introducción del ADNrec en la célula hospedadora para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto. Transformación. Transducción Euc: electroporación, microinyección, pistola de genes, Agrobacterium... Célula hospedadora *: - crecimiento rápido - ausencia de patogenicidad - captar o tomar e incorporar ADN del medio.

15 3.5. Detección del gen clonado.
3. Clonación de un gen 3.5. Detección del gen clonado. (detección de células transformadas). A través de los marcadores: Ejemplo de resistencia a un antibiótico por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina) las bacterias que se consideran transformadas, serán aquellas que sobrevivan en un medio con ampicilina. A través de sondas marcadas: por complementariedad con el gen clonado (hibridación).

16 3.6. Multiplicación de las células que contienen el gen clonado.
3. Clonación de un gen 3.6. Multiplicación de las células que contienen el gen clonado. Poner a las bacterias en un medio de cultivo apropiado para que se multipliquen (lo hace también el vector con el gen que interesa). El resultado es que se obtiene un clon de células que llevan todas ese gen de interés. Se pueden formar por tanto diferentes clones con genes de interés para el hombre. Cuando contienen el conjunto de genes de un organismo se denominan biblioteca genómica o genoteca. Si se clonan genes para que se expresen (produzcan la proteína) dentro de la célula hospedadora necesitamos vectores de expresión (sec reguladoras de transcripción y traducción) y el gen clonado ha de ser ADNc.

17 Secuenciación Técnica del dideoxi. Secuenciación automática.

18 PCR: reacción en cadena de la polimerasa
PCR: reacción en cadena de la polimerasa. (Aumenta el nº de moléculas de ADN) Ciclos de 3 fases: Desnaturalización. Anillamiento. Elongación.

19 Huellas dactilares del ADN.
APLICACIONES DE LA PCR Secuenciación Una de las razones mas comunes para el uso de la PCR es la formación de suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciación. Es mucho mas sencillo y rapido que la clonación en células. Estudios evolutivos Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos, como del mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir árboles filogenéticos. El PCR también se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano. Huellas dactilares del ADN. La determinación de las huellas dactilares genéticas constituye una de las aplicaciones mas interesantes de la PCR. Mediante esta técnica es posible comparar muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entre ellas. Esta técnica se aplica actualmente en Medicina forense e investigaciones policiales, con el fin de identificar indiividuos a partir de muestras biológicas, como sangre, semen, piel o cabellos. También se utiliza en las pruebas de paternidad.

20 4. Aplicaciones de la ingeniería genética
a) Aplicaciones médicas Producción de sustancias con efecto terapéutico. Técnicas de diagnóstico clínico. Terapia génica. Transplantes de órganos. b) Aplicaciones agropecuarias. Plantas transgénicas. Alimentos transgénicos. Animales transgénicos. c) Otras Aplicaciones de la PCR y otras técnicas para clonar genes, hacer estudios evolutivos, arqueológicos, forenses... Industria alimentaria:aditivos alimentarios, detección de fraudes, elaboración de productos lácteos y vinos...

21 4. Aplicaciones de la ingeniería genética
a) En Medicina OBTENCIÓN DE PROTEINAS DE MAMÍFEROS. Ej. Insulina humana en Saccharomyces cerevisae

22 4. Aplicaciones de la ingeniería genética
a) En Medicina OBTENCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES. Ej. Hepatitis B, meningitis meningocócica y rabia.

23 4. Aplicaciones de la ingeniería genética
a) En Medicina DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES DE ORIGEN GENÉTICO. Ej. Corea de Huntington.

24 4. Aplicaciones de la ingeniería genética
b) Agropecuarias ¿CÓMO SE HACE UNA PLANTA TRANSGÉNICA? 1. técnicas indirectas: transformación de células mediada por Agrobacterium tumefaciens. 2. técnicas directas: electroporación, microinyección, liposomas y métodos químicos.

25 APLICACIONES DE LAS PLANTAS TRANSGÉNICAS
4. Aplicaciones de la ingeniería genética APLICACIONES DE LAS PLANTAS TRANSGÉNICAS Resistencia a herbicidas, a insectos y a enfermedades microbianas. Ej. Bacillus thuringiensis (toxina - Bt) Incremento del rendimiento fotosintético transfieren los genes de la ruta fotosintética de plantas C4 que es más eficiente. Mejora en la calidad de los productos agrícolas Tal es el caso de la colza y la soja transgénicas que producen aceites modificados, que no contienen los caracteres indeseables de las plantas comunes. Síntesis de productos de interés comercial Existen ya plantas transgénicas que producen anticuerpos animales, interferón, e incluso elementos de un poliéster destinado a la fabricación de plásticos biodegradables. Asimilación de nitrógeno atmosférico se ensaya la transfección del gen nif responsable de la nitrogenasa.

26 ¿Cómo se hace un animal transgénico?
4. Aplicaciones de la ingeniería genética ¿Cómo se hace un animal transgénico? La transgénesis puede efectuarse siguiendo dos estrategias distintas: Transgénesis por microinyección de zigotos Transgénesis por manipulación de células embrionarias.

27 APLICACIONES DE LOS ANIMALES TRANSGÉNICOS
4. Aplicaciones de la ingeniería genética APLICACIONES DE LOS ANIMALES TRANSGÉNICOS Investigación: La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulación. Manipular de forma específica la expresión génica in vivo. Estudiar la función de genes específicos. La corrección de errores innatos de metabolismo mediante terapia génica. Biotecnología: Poder utilizar a mamíferos como biorreactores para la producción de proteinas humanas. Mejora de sus características para obtener mayor rendimiento económico.

28 4. Aplicaciones de la ingeniería genética ¿CÓMO SE CLONA UN ANIMAL?
El principio de la clonación está en la obtención de organismos idénticos genéticamente, y por tanto morfológica y fisiológicamente. Métodos: Por DISGREGACIÓN DE CÉLULAS EMBRIONARIAS:separar las células de un embrión en diferentes estados de desarrollo, desde el estado de 2 células hasta el estado de mórula. Cada célula separada puede funcionar como un zigoto que puede desarrollarse para dar un individuo completo. Por TRANSFERENCIA NUCLEAR: Se toman células embrionarias en fase de mórula o blástula, se cultivan in vitr ,y después se transfieren a ovocitos a los que se les ha quitado el núcleo. Se provoca la fusión de las dos células animales de modo que el núcleo de la célula embrionaria quede en el interior del ovocito, pudiendo éste empezar a funcionar como un zigoto.

29 CLONACIÓN POR TRANSFERENCIA NUCLEAR

30 4. Aplicaciones de la ingeniería genética
C) Medioambientales. La biorremediación consiste en recuperar el medio ambiente contaminado mediante la Biotecnología. Existen microorganismos capaces de captar y fijar metales pesados. Otros permiten recuperar un suelo o aguas contaminadas Depuración de aguas residuales (ver biotecn. I) Vertidos de petróleo: cepas que puedan trabajar a temperaturas muy bajas o que sus necesidades nutricionales se adapten al medio marino en el que van a desarrollar.  Residuos generados por explotaciones mineras: se está trabajando con cepas descontaminadoras, que puedan concentrar metales pesados o que aceleren el ritmo de descontaminación. Entre las plantas con actividad fitorremediadora se encuentran las crucíferas del género Brassica, capaces de acumular metales pesados y arsénico. Estas plantas son objeto de estudio y selección en los laboratorios de clonación.

31 5. Ingeniería genética y bioética.
PROYECTO GENOMA HUMANO                                                                       El Proyecto Genoma Humano comenzó en 1990 en los Estados Unidos con un presupuesto de millones de pesetas y un plazo de 15 años, con el objetivo de analizar molecularmente la herencia genética humana. Se trata de realizar mapas de cada uno de los cromosomas humanos. Implica dividir los cromosomas en pequeños fragmentos que puedan ser caracterizados y posteriormente ordenados en el cromosoma. El 26 de junio de 2000: el genoma humano fue descifrado en sus partes esenciales                                                        

32 Mapas genéticos: posición relativa de los diferentes genes
Mapas genéticos: posición relativa de los diferentes genes. Para esta confección se están estudiando la transmisión de caracteres hereditarios, capaces de ser objetivados de una generación a otra en grandes familias. Por ejemplo, en Estados Unidos se han localizado muchos genes gracias a estudios realizados en comunidades mormonas, cuya endogamia es notoria. En 1994 se terminó el primer mapa genético de todo el genoma humano.                                                                                                      Mapas físicos: Se obtiene la secuencia de nucleótidos de un gen. Se realiza fundamentalmente mediante la electroforesis en geles de distintos fragmentos de ADN y la ayuda de ordenadores. En 2000 se terminó el mapa físico del genoma humano.                                          

33 REPERCUSIONES ÉTICAS DE LA INGENIERÍA GENÉTICA
1975- Reunión Internacional en el Centro de Conferencias Asimolar de Pacific Grove, en California: directrices para el trabajo con el ADN recombinante. inicio de la investigación genética en la especie humana, clonación de embriones, etc.= creación de un Comité Internacional de Bioética, UNESCO. Problemas sanitarios. Apareción de nuevos microorganismos patógenos que provoquen enfermedades desconocidas, o el uso de fármacos de diseño provoquen efectos secundarios no deseados. Problemas ecológicos.   La liberación de nuevos organismos en el ambiente puede provocar la desaparición de especies contra las cuales se lucha, con consecuencias aún desconocidas, ya que cumplen una función en la cadena trófica de la naturaleza. Se puede pensar en posibles nuevas contaminaciones debidas a un metabolismo incontrolado. Problemas sociales y políticos.  Las aplicaciones de la Biotecnología en el campo de la producción industrial, agrícola y ganadera, pueden crear diferencias aún más grandes entre países ricos y pobres. El sondeo génico en personas puede llevar a consecuencias nefastas en la contratación laboral, por ejemplo, y atenta contra la intimidad a que tiene derecho toda persona. Problemas éticos y morales.  La experimentación en la especie humana puede atentar contra la dignidad de la misma. Poder conocer y modificar el patrimonio genético humano puede ser una puerta abierta al eugenismo. [Terapia Génica en células somáticas para corregir enfermedades. Prohibido en la línea germinal ]

34 Bioética Conocimientos y avances en Ingeniería Genética: patrimonio de la humanidad Los Organismos Internacionales creados para ello han de ser capaces de vencer las reticencias que crean los intereses políticos y económicos, logrando una legislación adecuada y justa, que recoja las voces razonables de todos los sectores sociales.