TRABAJO PRÁCTICO N° 3: Identificación microbiana

PARTE A: Identificación Fenotípica 1.-Pruebas Bioquímicas 2- Coloraciones 3. Uso del Manual Bergey

Pruebas Bioquímicas Son una serie de pruebas que permiten evidenciar una características determinada (ej: Física, metabólica) permitiendo formar un patrón que ayude a la identificación y diferenciación de un microorganismos de otros relacionados con el mismo

IMViC IMViC: conjunto de pruebas bioquímicas que comprende: I = Prueba del Indol M = Prueba de Rojo de Metilo V = Prueba de Voges-Proskauer C = Prueba de utilización de Citrato Permite la identificación por genero de entero bacterias (bacterias Gram negativas que provienen del intestino)

Prueba del Indol La prueba del indol estudia la capacidad de degradar el triptófano con producción de Indol y metabolitos indólicos.

Prueba de Rojo de Metilo Detecta la fermentación ácido-mixta. Se acumulan ácidos (acético, fórmico, etc.), relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta añadiendo un indicador (rojo de metilo) al cultivo.

Voges-Proskauer Detecta la fermentación butanodiólica. En esta  fermentación se producen una gran cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo, (alfa-naftol y KOH al 40%), se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoína).

Prueba de utilización de Citrato Detecta la capacidad de utilizar el citrato como única fuente de El medio es de color verde, si el microorganismo usa el citrato como única fuente de carbono, el medio vira al azul por liberación de NaOH.

Observación de los microorganismos Coloraciones Teñidos con colorantes Vivos sin teñir o en fresco Observación de los microorganismos Ventajas del uso de colorantes: Proporciona el contraste suficiente entre el microorganismo y el medio que los rodea, permitiendo diferenciar varios tipos morfológicos. Permite el estudio de estructuras de la célula bacteriana. Se puede obtener mayores amplificaciones con el empleo del objetivo de inmersión del microscopio.

¿Que es un colorante? Los colorantes son, generalmente, sales en las que uno de sus iones tiene color. Una sal es un compuesto formado por un ión cargado positivamente y un ión cargado negativamente. ClAM CL- + AM+ Los colorantes se pueden dividir en 2 grupos: básicos y ácidos. Si el colorante reside en el ión positivo, se dice que es un colorante básico. Si el color reside en el ión cargado negativamente, se dice que es un colorante ácido.

Pasos a seguir para realizar una coloración Como realizar un extendido

Permite diferenciar microorganismos en dos grandes grupos Coloración de Gram Gram positivos Gram Negativos Permite diferenciar microorganismos en dos grandes grupos

Pared Celular Gram positivos Gram Negativos

Alcohol disuelve los lípidos de la pared bacteriana deshidratación del peptidoglicano

¿Cómo se observan las bacterias y esporas según la coloración de Gram? Levaduras Esporas

COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN (BAAR) Permite identificar micobaterías. Por ejemplo: M. tuberculosis, agente causal de la tuberculosis y M. leprae, agente de la lepra. Se basa en la propiedad que tienen estas bacterias de resistir la decoloración con alcohol-ácido después de teñirlas con fucsina fenicada concentrada y en caliente Requiere preparación previa del frotis M. tuberculosis

TINCIÓN DE BURRI para cápsula Permite poner en evidencia la cápsula Bacteriana Como realizar un extendido CAPSULAS: REFRINGENTES SOBRE FONDO OSCURO Y EL CUERPO BACTERIANO TEÑIDO DE VIOLETA Klebsiella pneuminiae

TÉCNICA DE MOELLLER para esporas Permite poner en visualizar la Espora Bacteriana La espora se observará de color rojo El cuerpo vegetativo se observará azul

IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA para flagelos Permite visualizar los flagelos Los flagelos al ser tan finos (20 nm de diámetro), no pueden observarse mediante coloraciones comunes, sino que hay que recurrir a tinciones específicas que aumentan su diámetro Pandoraea spp

MANUAL BERGEY Su objetivo es asistir a la identificación de bacterias e indicar la relación que existen entre los distintos grupos El primer Manual Bergey de Bacteriología Determinativa fue publicado en 1923, bajo el auspicio de la Sociedad Americana de Bacteriólogos El último manual publicado en el 2000, corresponde a la 2° edición y consta de 5 volúmenes, a diferencia de los anteriores que presentaban un solo

A grandes rasgos los 5 subvolúmenes se dividen en: 1. Archaea, Cyanobacteria, Fotótrofos y Géneros ramificados. 2. Proteobacteria. 3. Bajo contenido en G+C. Gram positivas. 4. Alto contenido en G+C. Gram positivas. 5. Plantomicetes, Espiroquetales, Fibrobacter, Bacteroides y Fusobacteria. Las claves para ingresar al manual Bergey e identificar un microorganismo, son conocer : Tipo de metabolismo Forma y disposición celular Coloración de Gram Esto conducirá a la acertada elección de uno de Los 5 volúmenes

PARTE B: IDENTIFICACIÓN GENOTIPICA Técnicas moleculares Han surgido como los métodos para el análisis y tipificación de los aislamientos bacterianos. Se basan en las principales características que posee el ADN por ej: Homología de cadenas, replicación, polimorfismo, etc Poseen las siguientes ventajas: rapidez, sensibilidad, especificidad no necesitan microorganismo vivos

Técnicas moleculares Las mas utilizadas en microbiología son las siguientes: PCR- Reacción en cadena de la polimerasa RFLP - Polimorfismo de largos fragmentos de restricción Hibridación de ADN PFGE- Electroforesis en gel de campo pulsado

PCR- Reacción en cadena de la polimerasa La PCR amplifica de manera exponencial un fragmento especifico de ADN. Se utiliza para: Detección de enfermedades hereditarias, Análisis forense del ADN Detección de patógenos en el hombre Análisis de Paternidad

La PCR utiliza una enzima ADN-Polimerasa, que se produce naturalmente en los organismos vivos, donde funciona para duplicar el ADN cuando las células se dividen. Trabaja uniéndose a una sola hebra de ADN y creando una hebra complementaria Actualmente ha sido mejorado mediante el uso de la ADN-Polimerasa que procede de una bacteria termofílica que vive a temperaturas de 110°C La ADN-Polimerasa o Taq polimerasa tomada de estos organismos es termoestable (estable en las altas temperaturas

Para un ciclo de PCR se necesita: Enzima Taq polimerasa: amplifica el ADN ADN blanco a amplificar Primers: Fragmentos de ADN especificos a amplificar dNTP (desoxinucleotidos: dATP, dTTP, dGTP y dCTP) Buffer y sales de MgCl2

Etapas de cada ciclo de PCR

Análisis de PCR El producto obtenido se somete a electroforesis en gel de agarosa. Que permite separar los fragmentos por tamaños e identificarlos utilizando un patrón de ADN

FIN