Aplicaciones en Infectología PCR: Aplicaciones en Infectología Laboratorio de Biología Molecular Facultad de Medicina UASLP CA Garcia Sepúlveda MD PhD

Introducción Tan solo en los EEUUA, cada año se reportan entre 5 y 7 millones de enfermedades asociadas a infecciones. Se estima que un número mucho superior de enfermedades infecciosas no son reportadas cada año. Gran morbi-mortalidad de enfermedades infecciosas a nivel mundial. Las bacterias y virus continuan siendo una amenaza para la raza humana (2do riesgo despues de Homo sapiens). La intervención temprana (y apropiada) ante dichas patologías requiere de la identificación rápida del patógeno implicado, sobretodo en UCI, UCEN o SE en donde la vida del paciente pudiera estar en riesgo.

Introducción El desenlace clínico ante enfermedades infecciosas se encuentra directamente relacionado con el tiempo transcurrido para identificar al patógeno: Mayor tiempo = Peor pronóstico. Acercamiento diagnóstico actual (en la era posgenómica) sigue basandose en métodos tradicionales, engorrosos, lentos y poco sensibles. - Poco útiles ante escenarios de emergencia/críticos - Poca información resultante (Streptococcus spp) - Seguimiento con otros ensayos lentos de caracterización - Poco utiles en pacientes que reciben antibióticos

Introducción Consecuencias: Lleva a la adopción de estrategias clínicas empíricas y conservadoras. Lleva al abuso en la prescripción de antiobióticos. Incrementa el costo de la atención médica (incuso extrahospitalaria). Incrementa la tasa de hospitalizaciones innecesarias (hay un control?) Presiona a los patógenos a evolucionar más rápidamente o a escapar de escenarios de riesgo (resistencias, recombinantes nosocomiales, etc).

¿Que es la PCR? Reacción en Cadena de la Polimerasa Método enzimático para amplificar pequeñas regiones de DNA in vitro. Una sola bacteria no se puede estudiar, por lo que se hace uso de técnicas de cultivo para incrementar sus números de tal modo en que se puedan realizar estudios bioquímicos.

Invención Kary Banks Mullis, Ph.D. (Dic 28, 1944) Bioquímico norteamericano. Laureado Nobel (1993). Criado en Carolina del Norte EEUUAA en una granja. Trabajo en cardiología pediátrica, farmacéutica, sintesis proteica. Escribio ciencia ficcion por un tiempo y trabajo (como PhD) en una panaderia. Trabajo para Cetus donde divisó el mecanismo general subyacente de la PCR. Niega que el SIDA sea causado por HIV y niega el calentamiento global.

DNA Molécula que contiene información que define la manera en que un organismo debe: - armarse, - funcionar y - degradarse (morir). 3.4 nm (34 Å) 0.34 nm (3.4 Å) 2 nm (20 Å)

DNA Molécula de DNA es: - Bicatenaria - Complementaria - Antiparalela

DNA Molécula de DNA es: - Bicatenaria - Complementaria - Antiparalela G C C G A T T A G C C G A T T A G C C G

DNA Molécula de DNA es: - Bicatenaria - Complementaria - Antiparalela 5' 3' 3' 5'

Desnaturalización Reversible ¿Como se descontamina una superficie de DNA? - Detergentes o jabones - NaOCl - Calor - Acidos - Bases - Luz ultravioleta - Radiación actínica - DNAsas

Desnaturalización Reversible ¿Como se descontamina una superficie de DNA? - Detergentes o jabones ✗ - NaOCl ✗ - Calor ✗ - Acidos ✗ - Bases ✗ - Luz Ultravioleta ✓ - Radiación actínica ✓ - DNAsas ✓

Desnaturalización Reversible CONTEXTO: Una célula humana promedio contiene entre 6 y 9 picogramos de DNA. 46 cromosomas. 100,000 genes a 22,000 genes 3 mil millones de bases El cambio de tan solo 1 base es suficiente para alterar al organismo. PROBLEMA: Como detectar un cambio de 1 base entre 3 mil millones de bases?

Desnaturalización Reversible SOLUCION: PCR

Componentes Agua Buffer MgCl2 dNTPs (A,C, T, G) Oligoucleotidos Condiciones Agua Buffer MgCl2 dNTPs (A,C, T, G) Oligoucleotidos DNA Polimerasa DNA

Componentes Agua Buffer MgCl2 dNTPs (A,C, T, G) Oligoucleotidos Condiciones Agua Buffer MgCl2 dNTPs (A,C, T, G) Oligoucleotidos DNA Polimerasa DNA Estabiliza a la DNA polimerasa Amortigua pH Aportando iones necesarios (KCl) Puede contener aceleradores (Tween) Promotores de la reacción: FBS DMSO Gelatina

Componentes Agua Buffer MgCl2 dNTPs (A,C, T, G) Oligoucleotidos Condiciones Agua Buffer MgCl2 dNTPs (A,C, T, G) Oligoucleotidos DNA Polimerasa DNA Necesario para el correcto funcionamiento de la DNA polimerasa Su concentración modifica el éxito (nivel de amplificación) de la reacción.

Componentes Agua Buffer MgCl2 dNTPs (A,C, T, G) Oligoucleotidos Condiciones Agua Buffer MgCl2 dNTPs (A,C, T, G) Oligoucleotidos DNA Polimerasa DNA Monomeros que será polimerizados durante la reacción. Desoxyadenosin trifosfato (A) Desoxyguanosin trifosfato (G) Desoxycitidin trifosfato (C) Desoxytimidin trifosfato (T) No se puede crear DNA de la nada.

Componentes Agua Buffer MgCl2 dNTPs (A,C, T, G) Oligoucleotidos Condiciones Agua Buffer MgCl2 dNTPs (A,C, T, G) Oligoucleotidos DNA Polimerasa DNA Pequeños fragmentos de DNA (18-30 bp) Dirigen la polimerización de regiones específicas. DICTAN LA ESPECIFICIDAD DE LA REACCION!

Componentes Agua Buffer MgCl2 dNTPs (A,C, T, G) Oligoucleotidos Condiciones Agua Buffer MgCl2 dNTPs (A,C, T, G) Oligoucleotidos DNA Polimerasa DNA Es la responsable de polimerizar los monómeros (dNTPs) para formar copias de DNA. 5´-3´ Polimerasa 3´-5´ Exonucleasa

Componentes Agua Buffer MgCl2 dNTPs (A,C, T, G) Oligoucleotidos Condiciones Agua Buffer MgCl2 dNTPs (A,C, T, G) Oligoucleotidos DNA Polimerasa DNA Sirve de referencia o molde para la síntesis de nuevo DNA. Le indica el orden con el cual deben agregarse dNTPs a la DNA polimerasa.

Componentes Component ml Sterile Water 38.0 10X PCR Buffer 5.0 Condiciones Component ml Sterile Water 38.0 10X PCR Buffer 5.0 MgCl2 (50mM) 2.5 dNTP’s (10mM each) 1.0 PrimerFWD (25 pmol/ml) 1.0 PrimerREV 1.0 DNA Polymerase 0.5 DNA Template 1.0 Total Volume 50.0 Volumen de PCR común: Hace 10 años = 500 y 1000 µL Hace 5 años = 25 y 50 µL Hoy = 10 a 12.5 µL

Condiciones Desnaturalizar Hibridizar Extender Componentes Condiciones Acidos Bases Sales Detergentes Temperatura

Condiciones Desnaturalizar Hibridizar Extender Componentes Condiciones Acidos Bases Sales Detergentes Temperatura Incompatibles con DNA pol Ciclos de temperatura (Termociclaje) Thermophilus aquaticus = Taq

Termociclador Desnaturalizar Hibridizar Extender Componentes Condiciones Desnaturalizar Hibridizar Extender

Condiciones Componentes Condiciones Desnaturalizar Hibridizar Extender

Condiciones Componentes Condiciones Desnaturalizar Hibridizar Extender

Cinetica de la reacción 20 – 40 X Componentes Condiciones 95ºC 72ºC 55ºC Desnaturalización Hibiridización Extensión Hibrido= DNA + Oligonucleotido Depende de contenido GC% Dicta la especificidad de union del oligo al DNA

Cinetica de la reacción 20 – 40 X Componentes Condiciones 95ºC 72ºC 55ºC Desnaturalización Hibiridización Extensión Polimerasa Velocidad Exonuc Tasa Error %Prod -Mut Taq 2 Kb/min No 8.0x10-6 16 Pfu 0.5 Kb/ min Si 1.3x10-6 2.6 Pwo 1 Kb/min Si 0.4x10-6 0.7

Cinetica de la reacción

Cinetica de la reacción Componentes Condiciones nº ciclos DNA producto primers La especificidad está dictada por el diseño de oligos y optimización de la técnica. La sensibilidad del proceso es alta gracias a su elevada eficiencia. La eficiencia neta del proceso es tán elevada que permite amplificar una copia de DNA original a mil millones de copias en tan solo 30 ciclos (2 hrs)!

Proceso logarítmico (de tan solo 15 pasos): 1-2-4-8-16-32-64-128-256-512-1024-2048-4096-8192-16,384-32,768

Proceso logarítmico (de tan solo 15 pasos): 1-2-4-8-16-32-64-128-256-512-1024-2048-4096-8192-16,384-32,768

30 ciclos

Electroforesis (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Fosfatos y carga negativa del DNA responsable de migración electroforética. (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Electroforesis

Aplicaciones en Infectologia Facilita procesamiento de muestras DNA es muy estable (meses a años). Pequeño volumen de procesamiento y almacenamiento. Archivable. No requiere de red fria para transporte. Posee mayor sensibilidad que métodos tradicionales (serologicos) Teóricamente capaz de detectar una sola molécula de DNA. Muestras no viables pueden ser analizadas. Posee mayor especificidad. Reacciones cruzadas mínimas (calidad de diseño del oligo). Capaz de distinguir diferencias de tan solo UNA sola base nucleotídica. Permite identificar organismos dificiles o lentos de cultivar (Mycobact)

Aplicaciones actuales Multiplex PCR Detección simultánea de más de un patógeno en la misma reacción. Incorpora mayor número de oligonucleótidos. ½ del costo (obvio). Incrementa rapidez tamizaje.

Aplicaciones actuales Nested-PCR Anidada. Realizar una PCR sobre el producto de otra PCR. Detección de especies de DNA raras (en número) en muestras diluidas o con bajos títulos. Al menos cuatro oligos diferentes. Supra-sensible (detección).

Aplicaciones actuales Random-PCR Aleatoria. PCR poco específica que permite amplificar a muchas entidades (especies, bacterias, etc) en una sola reacción. Oligos dirigidos contra secuencias conservadas de bacterias (16S rRNA). Permiten ampificar a cualquier bacteria (bacteremias, meningitis, etc).

Aplicaciones actuales RT-PCR Reverse Transcriptase. PCR realizada sobre RNA. Expresión de genes (mRNA). Genomas virales RNA (HIV, Flu).

Aplicaciones actuales Q-PCR Quantitative. Permite cuantificar el nivel de los productos de PCR. Util para medir expresión de genes (mRNA). Utilisima para medir niveles de replicación viral (carga viral).

Aplicaciones clínicas

Aplicaciones clínicas

Conclusiones El diagnóstico molecular ha demostrado ser revolucionario para la práctica clínica del infectólogo (hospitalario o epidemiologo). Utilidad incomparable en escenarios críticos como UMQx, UCI y UCEN en donde es preciso contar con herramientas rápidas, sensibles y robustas para la toma de decisiones clínicas. La PCR sigue siendo la mejor técnica molecular que se haya desarollado y aunpromete mucho respecto a aplicaciones, optimización (costo y tiempo) y derivaciones (RT, QT, etc). Utilidad demonstrada para detección de patógenos, seguimiento clínico, vigilancia de patógenos emergentes, detección de amenzasa biológicas y detección de patógenos resistentes a fármacos.

Laboratorio de Biología Molecular Gracias Felicidades al personal del Laboratorio Estatal de Salud Pública en su décimo aniversario.