MIDI SHERLOCK® MICROBIAL IDENTIFICATION SYSTEM Maria c. Velázquez Rivas Ineza M. Rodríguez díaz

MIDI SHERLOCK® MICROBIAL IDENTIFICATION SYSTEM Myron Sasser, Ph.D. Fundador de MIDI inc. Desarrollador del MIDI SHERLOCK® MICROBIAL IDENTIFICATION SYSTEM Director de R&D

Temas Identificación microbial por ácidos grasos FAMEs ¿qué son? Técnicas principales para identificación bacteriana Análisis por FAMEs Ventajas del MIDI SHERLOCK Banco de datos de FAMEs Banco de datos: especies importantes Metodología Interpretación de resultados Resumen Nuevos Productos Referencias Sección de preguntas

objetivos Explicar como funciona la identificación de microorganismos utilizando análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs) Describir como funciona el sistema de identificación microbial MIDI SHERLOCK®

Identificación microbial por ácidos grasos La composición de ácidos grasos microbiales Son únicos por especie y sumamente conservados por nicho ecológico. Conservados genéticamente entre cepas. Mutaciones afectan ADN, no los ácidos grasos de la membrana. Intercambio de plásmidos entre bacterias no afecta el perfil de ácidos grasos.

Transesterificación de grasas con metanol FAMEs ¿qué son? FAMEs Fatty Acid Methyl Esters – ésteres metílicos de ácidos grasos Transesterificación de grasas con metanol Ácidos Grasos FAMEs Se forma un producto volátil (FAMEs) más adecuado para cromatografía de gas.

Técnicas principales para identificación bacteriana Pruebas Bioquímicas Requiere conocimiento y pruebas dirigidas. Conocimiento y uso adecuado de materiales. Secuenciación de ADN Requiere ciertas destrezas o conocimientos. Base de datos no incluye cepas variantes. Perfiles de ácidos grasos (FAMEs) Sencillez No requiere pre-pruebas. Preparación simple estándar.

Análisis por fames MIDI SHERLOCK® MICROBIAL IDENTIFICATION SYSTEM: Identificación de microorganismos por la composición de ácidos grasos en la membrana Identificación por cromatografía de gas (CG) Agilent® Gas Chromatograph Software Posee un estándar de calibración: Mezcla de calibración: ácidos grasos saturados de cadena lineal (9-20 C) y cinco hidroxiácidos.

Análisis por Fames No es necesario hacer tinción gram Identificación bacterias gram +/- Gram (+) predominan ácidos grasos ramificados Gram (-) predominan ácidos grasos en cadenas sencillas Lipopolizacáridos(LPS) promueven ácidos grasos hidroxilados Gram (+) Gram (-)

Ventajas del MIDI SHERLOCK Identificaciones precisas, más de 2,000 especies. Amplias bibliotecas microbianas y ambientales. Capacidad de realizar "tracking” por cepa presuntiva (para encontrar la fuente de un contaminante). Alto rendimiento 200 muestras por día Corto tiempo Bajo costo por muestra: $3 por muestra Todos los organismos son analizados utilizando el mismo procedimiento, sin necesidad de tinción Gram o pruebas bioquímicas.

Banco de datos de fames MIDI SHERLOCK LIBRARIES Catálogos de perfiles microbianos 1500 especies bacterianas 200 especies de levadura Cepas obtenidas de diferentes fuentes y nichos ecológicos. Colaboración con una red de investigadores Adición de organismos/cepas nuevas

Banco de datos: especies importantes Las entradas más grandes le pertenecen al género de Bacillus. 42 especies catalogadas Aceptado como un método oficial para la confirmación de B. anthracis

metodología Se crecen bacterias en agar Se selecciona colonias puras Inoculación Se crecen bacterias en agar Se selecciona colonias puras Recolección Extracción de células a partir de medios de cultivo Saponificación Lisis de las células para liberar los ácidos grasos de los lípidos celulares (Bacterias Mueren) Metilación Formación de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs) Extracción Transferencia de FAMEs de la fase acuosa a la fase orgánica Lavado Base Lavado acuoso de la extracción orgánica antes del análisis cromatográfico

metodología Reporte de identificación bacteriana por índice de similaridad Saponificación y metilación Cultivo Extracción Análisis por CG y comparación de resultados con bancos de datos de perfiles microbianos

Lectura de resultados: ejemplo

Interpretación de resultados Índice de similaridad Valor numérico que expresa cuan cerca está la composición de FAMEs de un desconocido con la media de la composición de cepas dentro del banco de datos. No es un por ciento, es una expresión de la distancia relativa de la muestra desconocida a partir de la media poblacional.

Interpretación de resultados 1.00 identificación perfecta 1.00-0.500 comparación buena 0.500-0.300 puede ser una cepa atípica 0.300 o menor, no es de la especie

Interpretación de resultados

Nuevos Productos MIDI Sherlock Instant FAMETM Muestras de aerobios ambientales y levaduras MIDI Sherlock Instant AnaerobeTM Muestras de anaerobios clínicos MIDI Sherlock Q-FAMETM Muestras de aerobios clínicos MIDI Sherlock DNA Software Analiza muestras de secuencias de ADN de especies de bacterias, hongos y levadura. Todos tardan entre 15-25 minutos para la identificación de cultivo puro

Resumen El MIDI SHERLOCK identifica microbios a base de su composición de ácidos grasos. Utiliza una base de datos sumamente amplia de FAMEs, incluyendo para muestras ambientales y diferentes nichos ecológicos. Es un sistema automatizado, fácil de utilizar, y de bajo costo por muestra. Se ha utilizado en diferentes áreas de investigación por los últimos 20 años ya que provee resultados constantes y precisos, en un tiempo razonable.

Referencias MIDI Recuperado de http://www.midi-inc.com/ Products: Sherlock® Microbial ID System (MIS) Recuperado de http://www.midi-inc.com/pages/microbial_id.html Kunitsky, C., Osterhout, G. and Sasser, M. Identification of microorganisms using fatty acid methyl ester (FAME) analysis and the MIDI Sherlock® Microbial Identification system Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. Recuperado de https://store.pda.org/TableOfContents/ERMM_V3_Ch01.pdf Sherlock® Microbial Identification system Automated Microbiology solutions. Recuperado de http://www.learneasy.ch/MIDI-GC-Full-Brochure.pdf Sasser, M. (2001) Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical Note #101Recuperado de http://www.microbialid.com/PDF/TechNote_101.pdf

¿Preguntas?