Bibliotecas TEJIDO VECTORES mRNA DNA cDNA DNA digerido (doble cadena metilado) DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTE INTRODUCCION EN CELULA HUESPED LIBRARY cDNA o genómica Bibliotecas cDNA BM 2009

Estrategia general construcción biblioteca de expresión Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4 Paso 5 Paso 6 (if necessary) Vectores usados: lgt10 lgt11 lZAP lTriplEx Paso 7 Paso 8 Paso 9 Paso 10 Bibliotecas cDNA BM 2009

Pasos 1 y 2: Fuente y purificación del mRNA Fuente de mRNA: Alta relación secuencia interés/ mRNA total. Baja tasa de degradación. Métodos de enriquecimiento: Uso de drogas para selección de líneas celulares o estímulos específicos. Fraccionamiento del mRNA o cDNA. Clonado sustractivo. Preparación de poliA+ mRNA T T T(30) 3´A A A 5´ Bibliotecas cDNA BM 2009

Transcriptasas reversas (RT): DNA pol RNA dependiente Paso 3: Síntesis de la primera cadena de cDNA Transcriptasas reversas (RT): DNA pol RNA dependiente ALV (Avian leukemia virus) y MoMLV (Moloney strain of murine leukemia virus) AAAAAA(A)nA 5´cap mRNA Transcriptasa reversa dATP dTTP dGTP dCTP AAAAAA(A)nA 3´ cDNA:mRNA TTTTTT(n)T Oligo dT AAA(A)nA 3´ AAA(A)nA Random primers Bibliotecas cDNA BM 2009

Por reemplazo Paso 4: Síntesis de la segunda cadena de cDNA dNTPs RNAasa H: nicks mRNA en mRNA:DNA DNA pol dNTPs cDNA doble cadena AAAAAA(A)nA RT con oligo dT TTTTTTTTTT Degradación RNA Transferasa terminal dCTP CCCCC Fragmento Klenow dNTP´s + oligo G GGGGG AAAAAAAAA Por reemplazo Bibliotecas cDNA BM 2009

Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado. Uso de adaptadores. Bibliotecas cDNA BM 2009

Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Oligo dT-primer adaptador. Bibliotecas cDNA BM 2009

Paso 3,4,5 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Metilación Paso 3,4,5 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Metilación. Uso de adaptadores. Fosforilación de los fragmentos antes de ligar al vector Bibliotecas cDNA BM 2009

Paso 3 y 4: Síntesis de la primera y segunda cadena de cDNA Esquema para la construcción de una biblioteca full-length Bibliotecas cDNA BM 2009

Fago l: Mapa génico Brazo izquierdo Brazo derecho Región central Cos Bibliotecas cDNA BM 2009

Fago l: Ciclo de vida Alta [C1] Baja [C1] Bibliotecas cDNA BM 2009 Activates C2 protein Alta [C1] Baja [C1] Bibliotecas cDNA BM 2009

Fago l Formación placas de lisis Ensamblado del bacteriófago Bibliotecas cDNA BM 2009

Construcción de vectores l Vectores: dejaron el 60 % del genoma l salvaje (crecimiento lítico) Tamaños que se empaquetan eficientemente: 105-78 % del genoma (10-20 kpb) Elección del vector: ER empleada. Tamaño del fragmento a ser insertado. Expresión del cDNA en bacterias. cDNA debe ser “rescatado” del vector l en forma de plásmido. Bibliotecas cDNA BM 2009

Pasos 7 y 8: Esquema preparación biblioteca en vectores derivados de fago l Vector desfosforilado Relación molar alta [Vector / inserto] Extremos no compatibles Ligación Selección-Screening Bibliotecas cDNA BM 2009

Formación placas de lisis l gt10: 5-11 kb Marcador de selección de fagos recombinantes: CI gen CI CI CI Lisogenia Lisis Esquema: lgt10-EcoRI cDNA- EcoRI Cepas E. coli hfl – (mutantes proteasa Hfl) NO degrada CII S! CI lisogenia Fagos CI D forman placas de lisis en cepas hfl- Ligación Empaquetamiento in vitro Infección E. coli hfl- Plaqueo en top agar Formación placas de lisis (amplificación) Screening hibridización sondas Bibliotecas cDNA BM 2009

formación placas de lisis Screening biblioteca: Plaqueo en top agar y formación placas de lisis Screening biblioteca: Hibridización con sondas Bibliotecas cDNA BM 2009

l gt11: 7 kb CI 857: mutante inactivo del represor a 45ºC EcoRI l gt11: 7 kb plac lacZ Inserción cDNA en EcoRI Proteína de fusión CI 857: mutante inactivo del represor a 45ºC S 100: mutación ambar en el gen S lisis Screening biblioteca de expresión: Inmunodetección Infección cepa E. coli SupF Incubación 10-15´ a 45ºC Inducción ciclo lítico Esquema: lgt11-EcoRI cDNA- EcoRI Ligación Empaquetamiento in vitro Infección E. coli Plaqueo en top agar. Incubación a 42ºC Formación placas de lisis Screening inmunodetección- Hibridización sondas Screening recombinantes IPTG/X-gal Bibliotecas cDNA BM 2009

Formación placas de lisis Screening inmunodetección l ZAP: 7 kb Esquema: pBluescript SK- lZAP (EcoRI/XhoI) cDNA (EcoRI/XhoI) Ligación Empaquetamiento in vitro Infección E. coli Plaqueo en top agar Formación placas de lisis Screening inmunodetección Clones positivos Recuperación de los clones positivos: Clon l recombinante positivo + M13 fago helper mutante XhoI SupE- lR I EcoRI T LB-Amp XL1-blue MRF´ SupE Bibliotecas cDNA BM 2009

Ribosome Binding Site (RBS) l TriplEx: expresión en tres marcos de lectura UAAGGAGG AUUCCUCC AUG 5’ 3’ mRNA 16S rRNA small ribosomal subunit Ribosome Binding Site (RBS) Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG Bibliotecas cDNA BM 2009

Pasos 9 y 10: Screening e identificación de los clones. Bibliotecas cDNA BM 2009 Pasos 9 y 10: Screening e identificación de los clones.