Clonación de fragmentos de DNA

Presentación del tema: "Clonación de fragmentos de DNA"— Transcripción de la presentación:

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2 Clonación de fragmentos de DNA

3 Minipreps Preparación de plásmido por lisis alcalina
Disolución P1 Tris 50 mM pH 8.0 EDTA 10 mM + RNasa 0.1 mg/ml Disolución P2 NaOH 0.2 N SDS 1% Disolución P3 Acetato potásico 3M Áciso acético 11% Birnboin H.C., Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic acids research 7(6): Birnboin H.C., Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for the isolation of plasmid DNA. Methods in Enzymology 100:

4 Endonucleasas de restricción

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7 Reacción catalizada por la DNA Ligasa
Lehninger. Principios de Bioquímica

8 La defosforilación con fosfatasa alcalina evita el religado del vector

9 La Fosforilación con polinucleótido quinasa facilita la ligación de fragmentos de DNA

10 SÍNTESIS QUÍMICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Síntesis en fase sólida de una cadena de DNA por el método del triéster fosfito (b-cianoetil) (Dimetoxitritilo) Finalmente se añade NH3 para eliminar los grupos protectores y liberar el oligonucleótido del soporte sólido

11 PUNTOS CLAVE DE UNA DNA POLIMERASA
Fidelidad. La mantiene en dos etapas: Sólo forma enlace fosfodiéster si el nucleótido entrante está correctamente empareado con el molde (error 10-4). Si el emparejamiento ha sido incorrecto y aun así se ha formado enlace, lo hidroliza con su actividad 3’ exonucleasa (error final 10-6) Eficiencia catalítica. Depende fundamentalmente de la procesividad (1minuto asociación-reasociación enzima-DNA; 1milisegundo adición de cada nucleótido)

12 COMPARACIÓN DE LAS DNA POLIMERASAS I, II Y III DE E. Coli
Lehninger. Principios de Bioquímica

13 Secuenciación de DNA Método de Sanger automatizado
Oligo: 5´--C T T A A - Molde: 3´--G A A T T C G C T A A T G C ---5´ - DNA polimerasa - Nucleótidos dATP, dCTP, dGTP, dTTP -Terminadores fluorescentes ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP Separación de los fragmentos de DNA marcados, mediante electroforesis capilar 5´--C T T A A G -3´ 5´--C T T A A G C -3´ 5´--C T T A A G C G -3´ 5´--C T T A A G C G A -3´ + Detector de fluorescencia 5´--C T T A A G C G A T -3´ láser 5´--C T T A A G C G A T T -3´ G C G A T T A C G 5´--C T T A A G C G A T T A -3´ 5´--C T T A A G C G A T T A C -3´ 5´--C T T A A G C G A T T A C G -3´

14        1 tggtcttcagATGTCTGATTCGCTAAATCA      150 accagaagtcTACAGACTAAGCGATTTAGT
      31 TCCATCGAGTTCTACGGTGCATGCAGATGA      120 AGGTAGCTCAAGATGCCACGTACGTCTACT       61 TGGATTCGAGCCACCAACATCTCCGGAAGA       90 ACCTAAGCTCGGTGGTTGTAGAGGCCTTCT       91 CAACAACAAAAAACCGTCTTTAGAACAAAT       60 GTTGTTGTTTTTTGGCAGAAATCTTGTTTA      121 TAAACAGGAAAGAGAAGCGTTGTTTACGGg       30 ATTTGTCCTTTCTCTTCGCAACAAATGCCc

15 Marcaje de sondas de DNA “Random primer”
5´-CAATGGCGCCCGGTATTCGTAGTTTCTGGCACCGCATTTCGGA-3´ ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: 3´-GTTACCGCGGGCCATAAGCATCAAAGACCGTGGCGTAAAGCCT-5´ DNA polimerasa dATP, dGTP, dTTP, 32P-dCTP Oligonucleótidos aleatorios 5´-CAATGGCGCCCGGTATTCGTAGTTTCTGGCACCGCATTTCGGA-3´ 3´-GTTACCGCGGGCCATAAGCATCAAAGACCGTGGCGTAAAGCCT-5´ 3´-GTTACCGCGGGCCATAAGCATCAAAGACCGTGGCG TAAAGC-5´ 5´-GCGCCC GGTATTCGTAGT 5´-TGGCAC CGCATTTCGGA-3´

16 Sistemas de expresión bacterianos

17 Sistemas de expresión bacterianos basados en la RNA polimerasa de T7

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19 Sistemas de expresión bacterianos: precipitación de proteínas recombinantes

20 Sistemas de expresión bacterianos: “refolding” de proteínas recombinantes

21 Utilización de transcriptasa reversa para obtener cDNA
exones I II III IV V VI VII VIII DNA Transcripción Pre- mRNA Maduración mRNA maduro AAAA Transcripción reversa TTTT cDNA AAAA

22 MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
Eliminación en la mayoría de los casos de la formilmetionina en procariotas y de la metionina iniciadora en eucariotas en el extremo N-t. Fosforilación de ciertos residuos de Ser, Thr y Tyr en algunas proteínas.

23 MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
Unión de grupos lipídicos (isoprenilación, palmitoilación, miristoilación)

24 MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
Glicosilación (adición de glúcidos) de residuos de Asn mediante enlaces N-glicosídicos o de residuos de Ser o Thr mediante enlaces O-glicosídicos. Formación de puentes disulfuro. Modificación proteolítica. Algunas proteínas, como la insulina, la tripsina, la quimotripsina, se sintetizan como precursores inactivos, y han de ser procesadas proteolíticamente para dar sus formas activas, más pequeñas.

25 Envío de proteínas al Retículo Endoplásmico

26 Sistemas de expresión en células animales

27 Introducción de DNA en células animales
Carácter transitorio. El DNA sólo es introducido en parte de las células del cultivo. No se aplica selección. El cultivo se recoge y analiza al cabo de unos pocos días. Carácter estable. El vector debe contener un marcador (p.ej. un gen de resistencia a un antibiótico) que permita seleccionar las células en las que se ha introducido el DNA e integrado en el genoma. Se pueden aislar clones individuales o trabajar con toda la población.

28 Introducción de DNA en células animales
Transfección. Polímeros catiónicos (DEAE-Dextrano, Polietilenimina (PEI) Fosfato cálcico Lípidos catiónicos Transducción. Partículas virales. Retrovirus Microinyección Electroporación.

29 Introducción de DNA en células animales
Transfección. Polímeros catiónicos (DEAE-Dextrano, Polietilenimina (PEI), FuGENE Fosfato cálcico Lípidos catiónicos (Lipofectamina)

30 Introducción de DNA en células animales
Electroporación.

31 Introducción de DNA en células animales
Transfección transitoria: éxito parcial

32 Introducción de DNA en células animales
Transducción Célula empaquetadora Célula diana

33 Introducción de DNA en células animales
Transducción

34 Sistemas de expresión inducibles

35 Transgénicos inducibles
collagen II tTA doxicyclin Collagenase 3 TRE

36 Transgénicos inducibles
collagen II tTA doxicyclin Collagenase-3 TRE