Crecimiento Luis A. N. Aguirrezábal UNMP-CONICET

Crecimiento En sentido estricto, crecimiento es el aumento irreversible del volumen de una célula. Por analogía, el concepto de « crecimiento » se extiende - a órganos, tejidos, individuos, poblaciones (ej. cultivo), comunidades, etc. - a otras variables: altura, peso fresco, seco, etc. Importante: IRREVERSIBLE Dos procesos subyacen al crecimiento de un órgano - expansión de células y tejidos - división celular Ambos se ecuentran COORDINADOS.

Porqué estudiar el crecimiento? Porqué interesarse en el crecimiento: 1 - La producción agrícola implica generalmente la obtención de un producto de un determinado tamaño (o rango de tamaños) ej. hojas, frutos, bulbos, tubérculos, flores, etc. * El tamaño es para muchos productos una variable de calidad que puede incidir sobre el precio del producto cosechado y o en la aceptación por los mercados. 2 -El crecimiento se encuentra implicado en la respuesta de la planta a cambios en las condiciones ambientales (incluyendo situaciones de estrés), lo que permite una mejor adaptación a dichas situaciones.

Respuestas de las plantas a cambios en las condiciones ambientales (estreses moderados) 1 - Ajustes de flujos 2 -Ajuste de la superficie de intercambio con el ambiente. a- Número de órganos b-Superficie de órganos

Respuestas de las plantas a cambios en las condiciones ambientales La planta responde a estreses (por ejemplo hídrico) 1 - Ajustando los flujos por unidad de superficie (ej. foliar) - Control de la apertura de estomas Tardieu et al 1993

Respuestas de las plantas a cambios en las condiciones ambientales La planta responde a estreses (por ejemplo hídrico) 1 - Ajustando los flujos por unidad de superficie (ej. foliar) - Control de la apertura de estomas En este caso, la menor conductancia estomática permite que la planta sometida a menor disponibilidad de agua mantenga el potencial agua foliar (no «sufre »’estrés). Si la disponibilidad hídrica no mejora, la menor transpiración provoca aumento de la temperatura foliar Tardieu et al 1993

La planta responde a estreses (por ejemplo mineral) 1 - Ajustando los flujos por unidad de superficie (ej. foliar) desrepresion de transportadores (ej transportadores de NH4+) Correlation between NH4+ Influx and AMT Gene Expression after Subjecting Roots to Nitrogen Deficiency. (A) 15NH4+ influx in Arabidopsis roots after transfer of hydroponically grown plants from 1 mM NH4NO3 to nitrogen-free nutrient solution. Uptake rates in 200 µM 15NH4+ were measured for 5 min (B) RNA gel blot analysis of expression of AtAMT1;1, AtAMT1;2, or AtAMT1;3. Gazzarini et al 1999

Respuestas de las plantas a cambios en las condiciones ambientales La planta responde a estreses (por ejemplo hídrico) 2 - Ajustando la superficie de intercambio total con el ambiente a- Número de órganos Medium deficit Potencial hídrico no afectado Regado Mild deficit : Fotosíntesis no afectada Déficit hídrico en arveja Lecoeur et al 1995

Respuestas de las plantas a cambios en las condiciones ambientales La planta responde a estreses (por ejemplo hídrico) 1 - Ajustando la superficie de intercambio total con el ambiente b- la superficie de cada órgano Genotipos de Arabidopsis thaliana sometidos a tres regímenes hídricos Aguirrezábal et al., 2006 Plant, Cell & Env, 29 (2216. 2217)

Respuestas de las plantas a cambios en las condiciones ambientales La planta responde a estreses 1 - Ajustando la superficie de intercambio total con el ambiente Los ajustes son principalmente a través de cambios en superficie de cada órgano, el número de órganos en general cambia relativamente menos. Superficie foliar total Número de hojas Valor en tratamiento bien regado Aguirrezábal et al., 2006 Plant, Cell & Env, 29 (2216. 2217) Respuesta (Valor tratamiento déficit hídrico / valor en tratamiento bien regado *100)

AREA FOLIAR – COBERTURA (SOJA) RIEGO SECANO R S 10cm

ALTURA DE PLANTA RIEGO SECANO 10cm

Porqué estudiar el crecimiento? La planta ajusta su funcionamiento en un ambiente fluctuante. EL AJUSTE DEL CRECIMIENTO DE LOS ORGANOS ES UNA RESPUESTA PRECOZ FRENTE A UN ESTRES HIDRICO. El principal mecanismo implicado es la expansión de tejidos y células. Boyer et al., 1970

Porqué estudiar el crecimiento? La planta ajusta su funcionamiento en un ambiente fluctuante. Existe variabilidad genética de la respuesta del crecimiento a un estrés. -0.2 -0.4 -0.6 0.0 0.3 0.6 Potencial hídrico del suelo (MPa) DEA Io F-2 F-252 D58 D61 D100 D137 Velocidad de alargamiento foliar (cm.°Cd-1) Reymond et al. , 2003

Arabidopsis Aguirrezábal, y otros. 2006 Plant, Cell & Env. 29: 2216-2227 La variabilidad genética fue menor en girasol que en Arabidopsis donde el tamaño final de hojas de un genotipo fue casi insensible al deficit hidrico por una compensación completa entre tasa y duración. Esta menor variabilidad era esperable pero suficiente para que existan respuestas contrastantes. Estas se podrían aprovechar para obtener variedades tolerantes. Girasol Pereyra Irujo y otros. 2008 J. Exp. Bot, 59 (8) 2221-2232

Análisis de curvas de crecimiento Tasa (pendiente) Duración

Déficit hídrico y ecotipos en At Aguirrezábal et al., 2006 Plant, Cell & Env, 29 (2216. 2217) testigo déficit hídrico AN-1 Dijon-M Col-O

Pereyra Irujo y otros. 2008 J. Exp. Bot, 59 (8) 2221-2232 Caracterización de genotipos contrastantes (girasol) Pereyra Irujo y otros. 2008 J. Exp. Bot, 59 (8) 2221-2232 Frente a un déficit hídrico: Disminuye la tasa de expansión de la hoja y puede aumentar (efecto positivo) la duración del periodo durante el que se expande la hoja.(Ej. HAR2) La disminución de la tasa de expansión de la hoja ocurre porque disminuye la tasa de expansión de las células y puede disminuir la tasa de división celular El incremento en la duración de expansión en HAR2 fue explicado no sólo por un incremento en la duración de la expansión celular sino también por un incremento de la duración de la división celular. Área de la hoja Tasa Rel. Exp. Tasa Rel. Div. Dos procesos coordinados subyacen al crecimiento de un órgano (expansión de células y tejidos y división celular).

Emergentes (Introducción) El crecimiento: En sentido estricto, crecimiento es el aumento irreversible del volumen de una célula. Pero es extendido a tejidos, órganos etc. 1 -Comprenderlo es fundamental en Agronomía y Biología 2 -Se encuentra implicado en la respuesta de la planta a cambios en las condiciones ambientales (ajuste de flujos, ajuste de superficie de intercambio con el ambiente). 3- El ajuste del crecimiento de órganos es una respuesta precoz frente a un déficit hídrico. El principal mecanismo implicado es la expansión de tejidos y células. 4 - Dos procesos coordinados subyacen al crecimiento de un órgano (expansión de células y tejidos y división celular). Los mecanismos biofísicos y bioquímicos de regulación son diferentes.

Distancia a la base (cm) La expansión de hojas. (Dónde, cuándo, cuánto) RER (cm/cm/°Cd) Distancia a la base (cm) 2 4 6 8 10 12 0.00 0.03 0.06 0.09 0.12 70 cm 60 50 40 30 20 cm En hojas de gramíneas, la zona de crecimiento ocupa un lugar fijo, independientemente de la longitud de la hoja (si las condiciones ambientales son constantes) Muller et al 2001

La expansión. (Dónde, cuándo, cuánto) La zona de crecimiento ocupa un lugar fijo, independientemente de la longitud de la hoja (si las condiciones ambientales son constantes) en gramíneas. Lo mismo ocurre en raíces de cualquier especie. 100 200 Longitud de células corticales (µm) 2 4 6 8 10 12 0.0 0.1 0.2 Distancia al ápice(mm) Tasa relativa de expansión (RER, h-1) Método: se hacen marcas equidistantes con tinta china y luego se mide como cambió la distancia Muller et al 1998

Ciclo celular. Su regulación División celular. Ciclo celular. Su regulación La velocidad de división celular - varía en el espacio (ej distancia al ápice de la raíz, base de la hoja) - puede ser afectada por el déficit hídrico, temperatura, luz Déficit hídrico Temperatura Cell division rate (cell cell-1 h-1) Distance to leaf insertion point (mm) 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.06 25.5°C 19°C 14°C 40 80 120 Watered Water deficit 0.08 Método para medir dónde se expanden los tejidos en gramíneas (matriz de agujas), Se realizan orificios equidistantes y luego se mide como cambió la distancia entre ellos Granier et al., 2000, Plant Physiol,124 :1393-1402

Ciclo celular. Su regulación División celular. Ciclo celular. Su regulación http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072495855/student_view0/chapter2/animation__how_the_cell_cycle_works.html http://www.cellsalive.com/cell_cycle.htm G0 - G1 S G2 M La duración del ciclo aumenta cuando la velocidad de división disminuye Cual es la etapa limitante? La duración de todas las fases aumenta proporcionalmente? Las células se encuentran bloquedas en una fase?

Ciclo celular. Su regulación División celular. Ciclo celular. Su regulación Cual es la etapa limitante? G0-G1 S G2 M Vant'hof (stress de carbono) % de núcleos 2C 4C G0-G1 S G2-M Nougarède (Gradiente espacial) Granier y Tardieu (Gradiente espacial) Francis (Stress Zn) Granier y Tardieu (Déficit hídrico) Granier y Tardieu (Radiación) Vant'hof (stress de carbono) La enzima clave es la pc34cdc2akinasa Su actividad refleja la velocidad de división celular Su regulación es compleja. Se encuentran implicadas numerosas proteínas, activadores e inhibidores. Los reguladores implicados serían diferentes para ‘gradiente espacial ’, diferentes tipos de stress (hídrico, carbono, etc.)

Emergentes (División celular) 1. Un modelo biofísico bien establecido (ciclo celular) describe formalmente la división celular. Las variaciones en su velocidad por efecto de estreses se deben principalmente a variaciones en la duración de la fase G0-G1. 2. El modelo bioquímico es complejo. La enzima identificada como clave posee una regulación compleja.

Expansión celular Cosgrove, 2005

Expansión Expansión de un tejido Expansión = aumento irreversible del volumen  deformación elástica Implica:

dV/(dt V) = L . ( D Yo(ext-int) - P ) Expansión Rol de la turgencia en la expansión de la célula La turgencia se opone a la entrada de agua en la célula (primera ecuación de Lockhart) dV/(dt V) = L . ( D Yo(ext-int) - P ) dV/(dt V) = velocidad relativa de expansión celular L= permeabilidad de paredes y membranas al agua La turgencia permite la expansión (segunda ecuación de Lochart). dV/(dt V) = m (P - Y) La turgencia es el    ’motor ’  de la expansión…..pero la turgencia no es suficiente para explicar las variaciones espaciales y temporales en la expansión. La expansión se encuentra regulada por las características mecánicas de la pared celular (m, Y)

Relación entre la presión de turgencia y la velocidad de expansión de los tejidos Las raíces pueden alargarse a bajo potencial agua (Yw) mientras que el crecimiento foliar es nulo al mismo potencial. El Yp : - no varía dentro de la zona de crecimiento (en la cual hay una importante variación espacial del alargamiento. - con Ya Spatial distribution of (A) relative elemental elongation rate, and (B) turgor in the apical 10 mm of maize primary roots grown at high (-0.02 MPa) or low (-1.6 MPa) Y in vermiculite. (Modified from Spollen and Sharp, 1991, Plant Phy, 96:438-443.) La turgencia es el    ’motor ’  de la expansión…..pero la turgencia sola no es suficiente. La expansión se encuentra regulada por las características mecánicas de la pared celular (m, Y)

Pared celular - Matriz = pectina/ hemicelulosa -Microfibrillas de celulosa ligadas a glicanos de tipo xiloglucanos. Esto permitiría ligar las microfibrillas entre sí (en monocotiledóneas, poco xiloglucanos, y más arabinoxilano y 1-3, 1-4 B glucanos)

síntesis de diferentes Estructura de pared primaria, síntesis de diferentes componentes Cosgrove, 2005

síntesis de celulosa Cosgrove, 2005

Cómo forma la hemicelulosa una red con las microfibrillas de celulosa? Diferentes modelos Cosgrove, 2005

Pared celular - Matriz = pectina/ hemicelulosa -Microfibrillas de celulosa ligadas a glucanos de tipo xiloglucanos. Esto permitiría ligar las microfibrillas entre sí (en monocotiledóneas, poco xiloglucano, y más arabinoxilano y 1-3, 1-4 B glucanos) Para que la expansión pueda producirse, la pared debe ser extensible, permitiendo la separación de microfibrillas y la incorporación de nuevo material. Las microfibrillas de celulosa no son extensibles y no son degradables. Sólo pueden desplazarse en relación con las otras La expansión de la pared depende de la ‘ red  ’ de microfibrillas

modelo biofísico para explicar la expansión de la célula Lockhart, 1965 - Green and Cleland, 1972

modelo biofísico para explicar la extensión de la pared celular Cosgrove, 1993, Plant Phy, 102 : 1-6 1- las cadenas de xiloglucanos se encuentran sometidas a tensión (presión de turgencia). 2 -una de las cadenas se distiende, la tensión se reduce (por efecto de ruptura de un puente hidrógeno, escisión de xiloglucano…) 3- entrada de agua en la célula, ocurre la expansión

modelo biofísico para explicar la extensión de la pared celular Modelo de Cosgrove, 1981 (continuación) Cómo se produce el relajamiento de la pared? Modelo de Cosgrove (1981) - la actividad de las enzimas implicadas en la relajación de la pared aumenta la extensibilidad de la misma , y por lo tanto el crecimiento de la célula (A). En consecuencia, la turgencia disminuye (B) permitiendo la entrada de agua, lo que restablece la turgencia a su nivel inicial(C).

Extensibilidad de las paredes celulares El crecimiento ‘ácido’ http://bcs.whfreeman.com/thelifewire/content/chp38/3802003.html Elong. rate pH 4.8 pH 6.8 De McQueen Mason, 1995, J Exp Bot, 46 : 1639-1650 El pasaje a pH ácido incrementa el alargamiento de las paredes provenientes de cualquiera de las zonas. Este experimento se realizó sobre fragmentos de pared pero esto ha sido verificado sobre órganos ‘ in planta ’

Extensibilidad de las paredes celulares El crecimiento ‘ácido’ De Cosgrove 1998, Plant Physiol 118: 333-339. A-Preparación de las paredes para probar el efecto de factores exógenos sobre su extensión. Se mata las células : no hay posibilidad de síntesis ‘ de novo ’ de la pared. B- El pasaje de pH 6.8 à 4.5 causa la extensión de la pared.

El crecimiento ‘ácido’requiere de proteinas‘ nativas ’ de pared. Evidencia del rol de las poteínas de la familia de las expansinas La extensión inducida por la acidez no se produce si se hierven las paredes …..pero la extensión se recupera si se agregan proteinas de pared nativas). Evidencia que las expansinas (30kDa) se encuentran implicadas De McQueen Mason, 1995, J Exp Bot, 46 : 1639-1650 De Cosgrove 1998, Plant Physiol 118: 333-339.

Qué son las expansinas? - proteínas extraidas de las paredes celulares y que permiten el crecimiento - rol catalítico no elucidado (‘ lubricante ’ en la pared por ruptura de uniones hidrógeno xiloglucanos-celulosa?) - familia multigénica (25 miembros en A. thaliana) - expresada en los frutos en maduración - sobreexpresión (tomate) = ablandamiento de tejidos - inducen la formación de primordios en el domo apical (tomate) - Un incremento de la ‘ actividad expansina ’² se encuentra asociada al mantenimiento del crecimiento de raíces de maíz sometidas a un déficit hídrico.

Modo de acción de las expansinas - No poseen actividad enzimática conocida (ni transglicosilasa ni hidrolítica) Hipótesis - cortarían las uniones hidrógeno (rol de ‘ lubricante ’) Se conocen además enzimas que modifican la extensibilidad

Enzimas que pueden modificar la extensibilidad de la pared (1) Aumentarla: xiloglucano endo transglicolasa (XET), Endoglucanasas (2) Disminuirla: Peroxidasas parietales XET: puede cortar y unir las moléculas de xiloglucanos entre sí.

Análisis de curvas de crecimiento Tasa (pendiente) Duración

¿Qué detiene la expansión de los órganos (cómo se determina la duración de expansión)? Durante algún tiempo después de detenerse el crecimiento, la expansión puede recomenzar, la pared no se rigidifica de manera “instantánea” En las dos especies la expansión de la hoja recomienza luego de reirrigar. Lechner et al, 2008 Annals of Botany, 101: 1007-1015 Pero esta respuesta disminuye con el tiempo hasta desaparacer (los tejidos se van rigidificando)

Enzimas que pueden modificar la extensibilidad de la pared La actividad XET es máxima cuando la expansión relativa es mayor, pero permanece alta en órganos que ya han finalizado su expansión. Tomate en expansión Un pico de actividad de peroxidasas parietales se encuentra asociado al final de expansión de órganos. Thompson et al., 1998, Plant, Cell and Env. 21: 589-599, frutos de tomate Lechner et al , SAIB, 2006, hojas de girasol Rol de XET para aumentar la extensibilidad de las paredes combinado con la actividad peroxidasa para ridificarla

Cosgrove, 2005

Enzimas que pueden modificar la extensibilidad de la pared La actividad XET es máxima cuando la expansión relativa es mayor, pero permanece alta en órganos que ya han finalizado su expansión. Tomate en expansión Un pico de actividad de peroxidasas parietales se encuentra asociado al final de expansión de órganos. Thompson et al., 1998, Plant, Cell and Env. 21: 589-599, frutos de tomate Lechner et al , SAIB, 2006, hojas de girasol Rol de XET para aumentar la extensibilidad de las paredes combinado con la actividad peroxidasa para ridificarla

Envejecimiento (“aging”) ocasionado por procesos aleatorios que determinan senectud Formación de radicales libres(ROS) y daños a diferentes organelas   En determinadas condiciones se satura la capacidad del sistema fotosintético para transportar electrones. Algunos clivan polisacáridos Se generan especies reactivas de oxígeno Oxígeno singlete 1O2* Especies reducidas - superóxido O2- Peróxido H2O2 de hidrógeno radical OH- hidroxilo

Rol de ROS Además del rol “negativo”de ROS se han postulado efectos “positivos” ligados a la acción no enzimática de ROS, especialmente de HO- sobre el clivado de polisacáridos de pared y su acción en el ablandamiento de la misma.

Rol de ROS Fry, 1998

Rol de ROS Además del rol “negativo”de ROS se han postulado efectos “positivos ligados a la acción no enzimática de ROS, especialmente de HO- sobre el clivado de polisacáridos de pared y su acción en el ablandamiento de la misma. El rol fisiológico de ROS en la expansión celular es aún discutido

Modelo bioquímico que describe la pared y la actividad de enzimas que pueden inducir la extensibilidad de las paredes Matriz = pectina/ hemicelulosa -Microfibrillas de celulosa unidas a glucanos de tipo xiloglucano que pueden unir entre sí las microfibrillas. - H+ ATPasa sobre membrana citoplasmática disminuyen el pH, activación de las expansinas - Expansinas: disminuyen la adhesión de las microfibrillas a la matriz. - Xiloglucano Endo Transglicosilasa (XET) : cortan y unen los glucanos de la matriz - Endoglucanasas cortan los xiloglucanos -Peroxidasas parietales: provocan la rigidificación de la pared

Emergentes Expansión de células y tejidos 1. Un modelo biofísico bien establecido (Lockhart) describe formalmente la expansión de células y tejidos. La turgencia es el    ’motor ’  de la expansión…..pero la turgencia sola no es suficiente para explicar las variaciones espaciales y temporales en la expansión. La expansión se encuentra regulada por las características mecánicas de la pared celular (m, Y) 2. El modelo bioquímico es menos completo. Se han identificado proteínas (expansinas) y enzimas (XET, peroxidasas parietales) relacionadas con la extensión de la pared. Las actividad y/o cantidad de las mismas se encuentra bajo control genético y/o ambiental (ej. déficit hídrico).

Emergentes (Crecimiento) El crecimiento es una variable de ajuste importante, rápida y sobre la que existe polimorfismo. Existen modelos formales para analizarlo (‘ análisis del crecimiento ’, ej. ver Trabajo teórico- práctico). Existen modelos bien formalizados para analizar los ‘ mecanismos ’ implicados (ej. los modelos biofísicos para expansión - Lockhart- y para división - ciclo celular). Estos marcos pueden ser utillizados para analizar el efecto de un estrés, detectar polimorfismo y buscar los genes asociados a sus controles