Biologia Molecular en Oncologia Parte 1 Dr. Oscar Alonso Luna

Temas Genes, Genómica y Cáncer – Introducción Tecnologías que están revolucionado la genómica en el tratamiento del cáncer

¿Cual es la diferencia entre estas dos frutas?

Descubrimiento del ADN

Células y DNA El cuerpo humano contiene ~100 trillones de células Cada célula contiene 23 pares de cromosomas ( = genoma) Los cromosomas contienen DNA Cada célula (excepto algunas cuantas) en un individuo contiene exactamente el mismo genoma Ed Radclyffe, CSIRO

Estructura del ADN

DNA a Proteína DNA RNA Función proteína Código Producto decodificado insulin El DNA en el genoma se interpreta para producir proteínas Los segmentos del DNA en el genoma llamados “GENES” codifican para proteínas Las proteínas son los productos funcionales finales en la célula.

Genomas a Organismos Embrión de Erizo de mar Embrión de ratón Embrión de alga Fucus Embrión humano Erizo de mar Ratón Alga Fucus Humano (conectado) Modificado del MCB 4a edición

Proyecto del genoma humano 23 pares de cromosomas 3 x 109 pares de bases (o nucleotidos) A, G, C & T Proyecto del Genoma Humano - 10 años y costó $2700 millones de dolares ACGTGCATCTGACATTTACTG …..

Variaciones del genoma humano – Polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) ~ 97 % del genoma entre dos individuos es idéntico. ~ 1% de las diferencias son variaciones de un solo nucleótido (SNPs) ~2% debido a otros cambios – variaciones en el número de copias, deleciones Entre 11-12 millones de SNPs se han identificado

Definiciones Genética: estudio de la herencia y de alteraciones en genes; también, el estudio de un solo gene Genómica: estudio de genes múltiples, sus funciones, evoluación y sus interacciones, actuando en conjunto Pruebas pronósticas de los genes: refleje la probabilidad de un cáncer para repetirse o la extensión fuera del sitio primario estas pruebas determina la probabilidad que un cáncer recurrirá o se detendrá. Pruebas Predictivas: indican la sensibilidad o la resistencia relativa a los tratamientos específicos, tales como quimioterapia o tratamiento hormonal Estas pruebas determinan la probabilidad que un cáncer responderá a un tipo de tratamiento en particular. 12

Que es el Cáncer?

Mutaciones Modified from: M. Meyerson, S.Gabriel, G.Getz, Nature Reviews Genetics 11, 685-696

Mutaciones somáticas identificadas en COLO-829 Tipo de cambio Cuenta Porcentaje Mutaciones somáticas identificadas en COLO-829 Sustituciones Codificantes Silenciosa Missense Truncante No codificantes UTR ncRNA miRNA Intrónicas Splicing Otras Intergénicas Inserciones y deleciones pequeñas Rearreglos Puntos de ruptura Intrónicos Intergénicos Clases Intracromosomales Deleciones Inversiones Duplicaciones Intercromosomales miRNA, microRNA; ncRNA, RNA no codificante; UTR, región no traducida

Genética ayuda a identificar pacientes de “High Risk” para desarrollar Cáncer Genética es el estudio de la herencia Genetica se enfoca primariamente en el como se desarrolla el cáncer… BRCA1 o BRCA2 Genética evalúa demostrar mutaciones, no enfermedades Genetics is the study of genes and heredity. Genomics is the study of genes, their functions, and related techniques. The main difference between genomics and genetics is that genetics studies how inherited traits are passed from one generation to the next, as well as how traits appear by means of mutations. Genomics studies a group of genes and their inter-relationships in order to identify their combined influence on the growth and development of the organism. Source: Understanding Cancer Series: Gene Testing, National Cancer Institute

Genómica ayuda a buscar Pacientes de una Biología Tumoral Individual Genómica es el estudio de como interactuan los genes genes y son expresados como un todo Genómica y los perfiles de expresión de genes son herramientas enfocadas en el cáncer mismo y pueden ayudar a determinar Cuanto agresivo es el cáncer (pronóstico) y/o Cuanto es beneficioso un particular tipo de tratamiento (predicción)

La Promesa de la Genómica Diagnóstico temprano y efectivo Anticipatorio, no reactive Predictivo y preventive Mayor individualización de las decisiones de tratamiento Terapia Dirigida basada en una enfermedad individual Mayor posibilidad de éxito en los estudios clínicos Más “drug discovery” racional Desarrollo de drogas más rápido Selección de pacientes Respuesta de los pacientes Más rápido de comercializar Entonces, Porqué es esto tan importante en el Cáncer? 18 18

Expresión Génica en el Cáncer Sobre-expresión génica Mitógenos, Factores de crecimiento. Oncogenes Silencio génico durante la diferenciación, Reparación del DNA, control mitótico y apoptosis Genes supresores de tumor o anti-oncogenes

Como se activan los oncogenes? Secuencia codificante Deleción o Mutación Puntual en la secuencia codificante Amplificación Génica Re-arreglo Cromosómico DNA RNA Proteína hiperactiva en cantidades normales Proteína normal ampliamente sobre-expresada Amplificación cercana ó fusión a un gen activo

Combinaciones de oncogenes frecuentemente asociados con algunos cánceres humanos Loci Afectado Tumor APC, MCC, DCC, KRAS2, P53 Cáncer Colorrectal HRAS, MYC Carcinoma cervical MYB, MYC, EGFR, HER2, HRAS, P53, RB1, BRCA1, BCL1, HSTF1, INT2 Carcinoma mamario JUN, MYC, MYCN, MYCL, HRAS, RB1, P53, RAF1 Carcinoma pulmonar HRAS, P53, RAF1, INT2 Carcinoma de células escamosas MYC, BLYM Linfoma de Burkitt P53 (EGFR, MYC, MYCN, GLI, HER2, PDGFB, ROS, TGF alfa Astrocitoma ABL Leucemia mieloide crónica

Que vías metabólicas están relacionadas con el cáncer? Anti-growth factors (e.g. TGFb) Tubulin WNT Frizzled Dishevelled GSK-3b APC TCF Cell TGFbR E-Cadherin b-Cutenin b-Cutenin:TCF p16 CdC42 PI3K Rac ECM Integrins Fak Cycl D:CDK+ p15 Smads Src Cas Crk Rb HPVE7 Fyn PLC p27 Growth factors (e.g. EGF, amphiregulin TGFa) Shc E2Fs Surface Ag NF1 PKC Mos MKKs JNKs JUN Cycl E:CDK2 p21 Grb2 DNA damage sensor RTK SOS Ras Ral MEK MAPK MAPK ELK Fos Changes in Gene Expression Cell Proliferation (cell cycle) Max:Max MEKK Myc:Max p53 Abl CdC42 Rac Rho GPCR ligands 7-TMR G-Prol Ad Cycl PKA CREB ARF MDM2 Nuclear receptors (e.g. oestrogen) NHR (e.g. ER) Bax PKC NF-kB NF-kB Mitochondria Stat 3.5 Survival factors (e.g. IGF1) Cell Death (Apoptosis) Bcl-2 RTK P13K Akt Akka IKB Caspase 8 FADD Stat 3.5 ? PTEN Caspase 9 Fap Fas Death factors (e.g. FasL) Cytochrome C Stat 3.5 Bcl XL Bcl-2 Decoy R Bad Mitochondria Bid Jaks Abnormality sensor Bim, etc. Cytokine R Cytokines (e.g. ILs, IFNs) Hanahan D, Weinberg RA. Cell 2000;100:57–70

Moléculas Candidatas para mutaciones causantes de cáncer (“oncogenes”=rojo) Efectores candidatos = verde Candidatos para blanco= amarillo

Fallas Moleculares del Tumor Primario Observational data of complex system gone wrong: Structure Causality?

William Cho 25

Genómica Funcional Los ensayos funcionales: Permiten perturbar los diferentes elementos del sistema y ver las consecuencias funcionales. Functional assays: let’s perturb different elements of the system and see the functional consequences

Integración de Datos por Pruebas Moleculares Tumor Primario Análisis Genómico … Una lista ordenada y registro de genes controladores. Haciendo uso de la gran escala de las pantallas funcionales que se están acumulando rápidamente. Lo mejor de ambos mundos: Integración de datos de los tumores primarios con pantallas funcionales en los datos genómicos.

Alteraciones Moleculares en la progresión del Cáncer - p 5 3 - p 5 3 - B R C A 1 , 2 - B R C A 1 , 2 p 5 3 G r o w t h f a c t o r , + H E R - 2 + H E R - 2 B R C A 1 h o r m o n e , E R + C y c l i n - D + C y c l i n - D B R C A 2 d e r e g u l a t i o n ? + m y c + m y c N o r m a l H i p e r p l a s i a I n S i t u I n v a s o r D i s p l a s i a C a r c i n o m a C a r c i n o m a

Temas Genes, Genómica y Cáncer – Introducción Tecnologías que están revolucionado la Genómica en el tratamiento del Cáncer

Tecnologías de Biología Molecular PCR en tiempo real Alta sensibilidad Alta precision DxS kit (CE) TIB MOLBIOL (CE) COBAS (CE)

MELTING CURVES Results show GAT (G12D), GTT (G12V), AGT (G12S), and TGT (G12C) mutations at codon 12 of the K-ras Curves represent GAT (G12D) and GTT (G12V) mutations at codon 12 of the K-ras gene.

Test usando sondas hidrolizables

Tecnologías de Secuenciación Tecnología de secuenciación de Primera generación Secuenciación Sanger Tecnología de secuenciación de Segunda generación Roche - 454 Illumina – GA II SOLiD Tecnología de secuenciación de Tercera generación Helicose PacBio Illumina = HiSeQ, MiSeq Ion Torrent Oxford Nanopore

Comparación de métodos Sequencing TIB MOLBIOL Taqman COBAS Probe preparation identical Tissue material requirement low medium Detection sensitivity (low level mutations < 5-10%) +/- +++ Work flow complexity complex simple Cost high Advantages of TIB MOLBIOL assay will allow future diagnostic application in tumor diseases with limited tumor tissue availability (e.g. lung tumors). Additionally, simple workflow requires less personnel, which will increase acceptance of diagnostic kit utilization.

Estrategias de la “Next Generation Sequencing” (NGS) Secuenciación de Genomas completos (WGS) Mutaciones somaticas en tumores Mutaciones de línea germinal y polimorfismos Secuenciación de exomas completos (WXS) Secuenciación de blancos de alteraciones accionables (ACGS) Soporte Informático

Ion Torrent (LifeTechnologies) – lecturas de 100bp reads, barato, fácil El aparato personal genómico ha sido diseñado con propósitos de investigación, ofreciendo cargar un iPod mientras que analiza DNA. Tiene un puerto iPod en la parte superior… La plataforma usa sensores semiconductores en paralelo para medir los iones hidrógeno producidos durante la replicación del DNA en tiempo real (pH…). Es el primer aparato en usar este tipo de tecnología superconductora, mientras que continua el uso de fluidos integrados y micromaquinaria para traducir la información en nuestro DNA a información digital fácilmente medible. http://www.iontorrent.com/?s_kwcid=TC-12648-4977112303-p-652132722

Next Generation Sequencing First Generation Sequencing

Clinical therapeutics consultation “Drugs for a patient, or patients for drugs.” Manuel Hidalgo, MD Clinical care or clinical trial

Investigación tradicional vs aplicaciones “High-throughput” William Cho 39

Royal Mail Stamp Issue 25 February 2003 The doctor’s perspective Royal Mail Stamp Issue 25 February 2003

The patient’s perspective EVOLUTION FROM and Anatomic and DISEASE-BASED TO A MORE PERSONALIZED-BASED MEDICINE

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