Contribución electrostática de los residuos aromáticos en el receptor de anestésicos locales de los canales de sodio dependientes de voltaje http://einstein.ciencias.uchile.cl Osvaldo Alvarez 19 ene 2009

Electrostatic Contributions of Aromatic Residues in the Local Anesthetic Receptor of Voltage-Gated Sodium Channels Christopher A. Ahern, Amy L. Eastwood, Dennis A. Dougherty, Richard Horn Circ Res. 2008;102:86-94.

Lidocaína H+ 1 A Estructura de la lidocaína protonada Potencial electrostático de la lidocaína protonada. Escala pseudocolor desde 0 (rojo) a +150 (azul) kcal/mol

H+

D2,D3,D4 pore loops D3 pore helix D4 pore helix D2 pore helix D2 S6 D4 S6 Residuos aromáticos en el supuesto receptor de anestésicos locales de los canales de sodio dependientes de potencial eléctrico

21.6 A Lidocaina 11x6A La lidocaína puede interactuar simultáneamente con los residuos aromáticos F1579 y Y1586

Estructura electrónica del benceno. Morrison and Boyd Organic Chemsitry 3ª edición Allyn and Bacon Inc. Boston 1973.

Potencial de superficie del benceno.

H C H C C H H C C H C H Cargas parciales de los átomos del benceno. +0.1 H C H C C H +0.1 -0.1 +0.1 -0.1 -0.1 H C -0.1 -0.1 C H +0.1 -0.1 +0.1 C qcarbonos = -0.1 e0 qhidrógenos = +0.1 e0 Gromos force field H +0.1 e0 = 1.6 10-19 coulomb Carga neta cero. Momento dipolar cero.

Cargas parciales de los átomos del benceno. Carga neta cero. Momento dipolar cero. Si pongo un catión cerca del anillo, como se muestra en la figura, va a quedar más cerca de las cargas negativa que de las carga positiva. La energía de la interacción es favorable y se puede calcular usando esta expresión. 0 = 8.85 10-12 C2N-1m-2 permitividad eléctrica del vacío  = constante dieléctrica del medio U en kcal/mol r en angstrom

kcal/mol A Li+-C6H6 38.4 1.9 Na+-C6H6 22.0 2.4 K+-C6H6 17.5 2.9 Rb+-C6H6 16.3 3.1 Cs+-C6H6 15.4 3.4 (C6H6)Li+-C6H6 24.8 2.0 (C6H6)Na+-C6H6 19.0 (C6H6)K+-C6H6 16.1 (C6H6)Rb+-C6H6 14.9 (C6H6)Cs+-C6H6 14.0 Sequential bond dissociation energies (BDEs) of the mono- and bis-benzene complexes with alkali metal cations (Li+, Na+, K+, Rb+, and Cs+) determined experimentally by collision-induced dissociation (CID) with Xe in a guided ion beam mass spectrometer. Absolute Binding Energies of Alkali-Metal Cation Complexes with Benzene Determined by Threshold Collision-Induced Dissociation Experiments and ab Initio Theory Jay C. Amicangelo and P. B Armentrout* J. Phys. Chem. A 2000, 104, 11420-11432

Cation- Interactions in Simple Aromatics: Electrostatics Provide a Predictive Tool Sandro Mecozzi, Anthony P. West, Jr., and Dennis A. Dougherty* J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 2307-2308

Cation- Interactions in Simple Aromatics: Electrostatics Provide a Predictive Tool Sandro Mecozzi, Anthony P. West, Jr., and Dennis A. Dougherty* J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 2307-2308

El propósito de la investigación es demostrar la contribución electrostática de los residuos aromáticos electrostática al sitio de unión de los anestésicos locales al canal de sodio. La estrategia es introducir amino ácidos no-naturales en el lugar de Phe1579 con sustituciones de flúor en el anillo y medir la afinidad del canal por la lidocaína usando experimentos biofísicos. Resultados esperados: Los canales de sodio con Phe1579 fluorada mantienen sus propiedades biofísicas. La introducción de átomos de flúor en el añillo aromático disminuye la afinidad de la lidocaína por su sitio en los canales de sodio.

¿Cómo se ponen amino ácidos no naturales en la proteína? Nowak MW, Gallivan JP, Silverman SK, Labarca CG, Dougherty DA, Lester HA. In vivo incorporation of unnatural amino acids into ion channels in Xenopus oocyte expression system. Methods Enzymol. 1998; 293:504 –529.

El tRNA que tiene el anticodon CUA es originalmente el de glutamina en Tetrahymena thermophila, modificado para que no sea atacado por las enzimas del oocito. An Engineered Tetrahymena tRNAGln for in Vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins by Nonsense Suppression (1996) Margaret E. Saks, Jeffrey R. Sampson, Mark W. Nowak, Patrick C. Kearney, Fangyong Du, John N. Abelson, Henry A. Lester, and Dennis A. Dougherty JBC 271:23169–23175

El propósito de la investigación es demostrar la contribución electrostática de los residuos aromáticos electrostática al sitio de unión de los anestésicos locales al canal de sodio. La estrategia es introducir amino ácidos no-naturales en el lugar de Phe1579 con sustituciones de flúor en el anillo y medir la afinidad del canal por la lidocaína usando experimentos biofísicos. Resultados esperados: Los canales de sodio con Phe1579 fluorada mantienen sus propiedades biofísicas. Los canales los expresan en oocitos de Xenopus laevis y miden corrientes de sodio usando voltage clamp de dos electrodos..

5ms Familias de corrientes de sodio registradas para despolarizaciones de 15 ms de -30 a +25 mV desde un potencial de holding de -100mV.

Conductancia en el pico, normalizada Cha = cliclohexil alanina Conductancia en el pico, normalizada

Curva de inactivación.

Efecto de la lidocaína ( 5 min, 200 mM)sobre la curva de inactivación.

5 ms Tyr ------------Phe-------------- No hay contribución electrostática al la inhibición tónica por lidocaína Efecto tónico de la lidocaína sobre la corriente pico. Corrientes registradas antes y después de 5 min bajo lidocaína 200mM, pulsos de 15 ms a -20 mV a 0.05 Hz.

Efecto de la lidocaína dependiente del uso sobre la corriente pico Efecto de la lidocaína dependiente del uso sobre la corriente pico. Lidocaína 200mM, 50 pulsos de 15 ms a -10 mV desde -100 mV a 20 Hz. Las figuras muestran los 10 primeros pulsos superpuestos, más el decimo quinto ( 50th) P1 es el primero y P50 es el último Hay contribución electrostática a la inhibición uso- dependiente de Phe1579 pero no de Phe1586

Efecto de la lidocaína dependiente del uso sobre la corriente pico Efecto de la lidocaína dependiente del uso sobre la corriente pico. Lidocaína 200mM, 50 pulsos de 15 ms a -10 mV desde -100 mV a 20 Hz. Las figuras muestran la razón entre la amplitud de la corriente del puso décimo quinto y el primero, P50/P1. Hay contribución electrostática a la inhibición uso- dependiente de Phe1579 pero no de Phe1586

Definición operacional de la constante de inhibición: razón entre la amplitud del de la corriente pico medida en el pulso P50 y la medida en el pulso P1, en presencia lidocaína 200mM, estimulando a 20 Hz. Cálculo del cambio en la energía libre por efecto de la alteración de la estructura del amino ácido aromático. 1.38E-23 joule/K 8.31E+00 joule/Kmol 0.2389 cal/joule 1.99E+00 cal/Kmol 293 K 5.82E+02 cal/mol 0.58 kcal/mol

Correlación entre el cambio de energía de unión entre lidocaína y el las mutantes del canal de sodio con derivados de la fenilalanina y de sodio con los mismos derivados(*). (*)Ma JC, Dougherty DA. The cation- interaction. Chem Rev. 1997;97: 1303–1324.

Recuperación de la inactivación

D2,D3,D4 pore loops D3 pore helix D4 pore helix D2 pore helix D2 S6 D4 S6 Queda demostrado que hay interacción electrostática entre lidocaína y los electrones pi del residuo Phe1579, pero no con los de Tyr 1574 ni Tyr1586.

La lidocaína es anestésico porque inhibe los canales de sodio. Los canales con la Phe 1579 fluorada son insensibles a la lidocaína. La inhibición por lidocaína es uso-dependiente. Ahern et al Circ Res. 2008;102:86-94. Canales de sodio expresados en oocitos. Voltage clamp de dos electrodos. Corrientes provocadas por 100 pulsos a -10 mV desde -100 mV en presencia de lidocaína 80 mM. Se muestra 1 de cada 10 trazos. NaV1.4 WT y con Phe1579 fluorada.

5 ms Canales de sodio expresados en oocitos de Xenopus laevis. Voltage clamp de dos electrodos. Familias de corrientes tomadas desde -30 a +25 mV en pasos de 5 mV.

Phe 380 Modelo de canal de potasio de conductancia alta activado por calcio

Lippidiat, J. D, N. B. Stanmden and N. W Davies 2000 Lippidiat, J.D, N.B. Stanmden and N.W Davies 2000. A residue in the intacellular vestibule of the pore is critical for gating and permeation in Ca2+-activated K+ (BKCa) channels Journal of Physiology 529:131-138

M. Carboni, Z. -S. Zhang, V. Neplioueva, C. F. Starmer, A. O M. Carboni, Z.-S. Zhang, V. Neplioueva, C.F. Starmer, A.O. Grant (2005) Slow Sodium Channel Inactivation and Use-dependent Block Modulated by the Same Domain IV S6 Residue. J. Membrane Biol. 207:107-117

M. Carboni, Z. -S. Zhang, V. Neplioueva, C. F. Starmer, A. O M. Carboni, Z.-S. Zhang, V. Neplioueva, C.F. Starmer, A.O. Grant (2005) Slow Sodium Channel Inactivation and Use-dependent Block Modulated by the Same Domain IV S6 Residue. J. Membrane Biol. 207:107-117

M. Carboni, Z. -S. Zhang, V. Neplioueva, C. F. Starmer, A. O M. Carboni, Z.-S. Zhang, V. Neplioueva, C.F. Starmer, A.O. Grant (2005) Slow Sodium Channel Inactivation and Use-dependent Block Modulated by the Same Domain IV S6 Residue. J. Membrane Biol. 207:107-117

M. Carboni, Z. -S. Zhang, V. Neplioueva, C. F. Starmer, A. O M. Carboni, Z.-S. Zhang, V. Neplioueva, C.F. Starmer, A.O. Grant (2005) Slow Sodium Channel Inactivation and Use-dependent Block Modulated by the Same Domain IV S6 Residue. J. Membrane Biol. 207:107-117