Estructura tridimensional de macromoléculas : su determinación usando difracción de rayos X o se trata de biología estructural…?

Las estructuras secundarias y terciarias de las macromoléculas, conllevan información clave para determinar las funciones bioquímicas y celulares mioglobina Proteína A

Sitios activos en 3D Diagrama 2D

In vivo In vitro Ecosistemas Comunidades Ecología Poblaciones Organismos Fisiología In vivo Tejidos Histología Biología celular Células Moléculas Biología molecular / bioquímica In vitro Biología estructural Atomos

Biología estructural Técnicas biofísicas : Cristalografía de rayos X Calorimetría Microscopía electrónica ≠ técnicas espectroscópicas (CD, EPR, …) RMN Espectroscopía de masa Dispersión de luz Espectrofluorometría ………….

Biología estructural La estructura 3D de moléculas biológicas nos permite contribuir a entender : qué moléculas interactúan? cómo? rearreglos conformacionales disparados por la interacción cómo hacen las enzimas para catalizar reacciones?

…para describir la forma (y la topología) de algo, lo mejor es… MIRARLO! lentes objeto imagen Es muy pequeño?… usá un microscopio …

Espectro electromagnético … pero… el problema del límite de resolución! Tamaños relativos entre el objeto a estudiar y la longitud de onda Espectro electromagnético La longitud de onda de los rayos X usados en cristalografía : 1Å - 3Å (Å = 10-10m) ; lo más típico 1.54Å (Cu ) Frecuencia = c/l =(3x108m/s) /(1.54x10-10m) ≈ 2x1018 s-1

… pero, no podemos (aún?) fabricar un microscopio de rayos X : no hay lentes aun si las tuviéramos, deberíamos poder pulirlas con una precisión mejor a 0.1Å!! Necesitamos aprender a interpretar los patrones de difracción de rayos X (no refocalizados), para reconstruir la distribución de densidad electrónica que difractó

Mapa de densidad electrónica Proteína purificada Cristales Difracción de rayos X Obtención de fases Mapa de densidad electrónica Construcción de modelo Refinamiento Validación

Institut Pasteur de Montevideo X RAY DIFFRACTION FACILITY

Setup experimental para hacer difraccion de cristales unicos Resultado experimental: estructuras a resolucion atomica

Qué es un cristal? La materia se clasifica en gases, líquidos y sólidos (también hay mezclas homogéneas que están digamos "en el medio"!! coloides, sólidos amorfos, etc) Sólidos: volumen fijo, incompresibles, comportamientos anisotrópicos interacciones intermoleculares fuertes orden

Estructura cristalina = motivo * red cristalina Orden Explica el comportamiento anisotrópico (óptico, mecánico, magnético, eléctrico, etc) Arreglo ordenado a largas distancias entre moléculas (simetría, capas o planos moleculares) Estructura cristalina = motivo * red cristalina

Estructura cristalina = motivo * red cristalina Orden Estructura cristalina = motivo * red cristalina molécula celda unidad cristal

Teoría Los diagramas de fase grafican la solubilidad de las proteínas bajo distintas condiciones

Teoría Saturación las velocidades de pérdida/ganancia de las fases sólida y líquida son iguales, el sistema está en equilibrio Salting-out región derecha del diagrama, la solubilidad de la proteína se reduce a medida que la concentración de sal aumenta Salting-in región izquierda del diagrama, la solubilidad de la proteína aumenta con la concentración de sal

Qué es lo que queremos? Agregación ordenada!

La sobresaturación controlada aumenta la probabilidad de nucleación

Experimento de difusión de vapor Métodos Experimento de difusión de vapor pequeños volúmenes de precipitante y de proteína son mezclados en una gota que se deja equilibrar contra un reservorio de mucho más volúmen conteniendo precipitante u otro agente deshidratante gota colgante

gota sentada sandwich

Tipico setup de difusión de vapor

Experimentos de diálisis Experimentos en batch Se pueden usar diferents relaciones prot/precipitante

Veamos un experimento de difusión de vapor Aún sin cristales… Veamos un experimento de difusión de vapor Cristales creciendo!!!

…o un experimento en batch… Ahora A, B y C son distintos experimentos

…o diálisis región de salting-in región de salting-out cambiando buffers

Condiciones de screening Los parámetros que típicamente son variados: Concentración de proteína (comenzar lo más alto posible) Precipitante (PEG’s, SA, solventes, sales concentradas, etc) Presencia de sales (u otros “aditivos”) pH y tipo de buffer Temperatura

Condiciones de screening Estrategias de screening : Factorial completa Factorial incompleta Aleatoria Rala ("sparse")

Calidad de la proteína Está pura? el requisito más importante hacer (SDS-PAGE, MS) + (SEC, IEC) Está plegada correctamente? testear actividad si se tiene un ensayo testear el espectro CD (o PAGE nativo) Es fresca? Es monodispersa? monodispersión significa que la proteína existe en solución como una única especie de estructura terciaria/cuaternaria determinada (homogeneidad conformacional) usar una columna de exclusión por tamaño (SEC) como último paso de purificación usar dispersión de luz (DLS o SLS) como control de calidad

Observación Hay ± 9 cosas distintas que se pueden llegar a ver, a veces combinando más de una en la misma gota Gotas claras Materia Precipitado Geles Piel Separación de fases Aceites Esferulitas Cristales Precipitado microcristalino 1D - agujas 2D - placas 3D - gemas

Algunas fotos…

…algunas más…

un cristal demasiado observado nunca crece!! Optimización Cuando se llega a identificar algo "interesante" se procede a Rastrear alrededor de la condición ("afinar") Usar aditivos Sembrar gotas frescas preequilibradas, con el material "interesante" : micro and macro-seeding un cristal demasiado observado nunca crece!!

Tomar la primer foto! El único requerimiento para considerar un cristal de proteína como 'bueno' es que difracte La difracción depende de : Tamaño La intensidad de dispersión es proporcional al número de celdas unidad en el cristal El N° de celdas unidad es proporcional al volúmen del cristal (duplicando todas las dimensiones de un cristal cúbico dará reflexiones ~8 veces más intensas) El N° de celdas unidad de un cristal depende del tamaño de las celdas (tamaño de la proteína, cuan compacto sea el empaquetamiento, N° de proteínas en la unidad asimétrica, simetría) Orden La difracción depende de cuan idénticas son las celdas unidad.

Tomar la primera foto! Encontrar la concentración mínima de crio-protector para el licor madre (criocristalografía) Poner el cristal en la solución crioprotectora por x tiempo, y montarlo en un loop no hay difracción débil (anisotrópica) 10 Å prometedora 4.5-6 Å buena < 3 Å Fuerza Colectar una imagen con un ángulo de oscilación grande. Si el cristal es de sal, los puntos van a estar bien alejados y podrían no verse si se toma un ángulo pequeño. Si lamentablemente es sal, se verán puntos muy intensos difractando aun a muy alta resolución (celdas unidad muy pequeñas, bien ordenadas) Calidad de la difracción cristal múltiple / split cristal único muy mosaico cristal único Calidad

Sabemos entonces por qué usamos rayos X … Pero por qué obtenemos densidad electrónica? Qué son los rayos X? Fotones = un campo eléctrico oscilante* *también un campo magnético oscilante de la misma frecuencia, pero ortogonal y desfasado 90°

E(t) = A cos(wt + a) Qué son los rayos X? Fotones. Un campo eléctrico oscilante E Amplitud t a (fase) long. de onda E(t) = A cos(wt + a) w=2pc/l

Un electrón en un campo eléctrico oscilante Los electrones e- orbitan a una velocidad aprox 1/100th c (≈2x106m/s), Por lo que en un ciclo del haz de Rx, e- viajará 2x106m s-1 / 2x1018s-1 = 10-12m = 0.01Å (no mucho comparado al tamaño del átomo) En otras palabras, los Rx ven a los e- como si estuvieran quietos.

e- oscilan en un campo eléctrico... la oscilación de e- tiene la misma frecuencia que los Rx la oscilación de e- es mucho más rápida que el movimiento de orbitado la amplitud de la oscilación de e- es grande porque la masa de e- es pequeña. Los núcleos atómicos no oscilan apreciablemente E e- t

…cargas en oscilación crean fotones! Å hn e- …en todas direcciones Esto es DISPERSION!

En el fenómeno de dispersión hay al menos 3 efectos : Fotoeléctrico --->> absorción Compton (interacción incoherente) Thompson o difracción de Bragg (coherente, elástica)

Dispersión de Thompson I I0 (1 + cos2) 2r2m2c4

Por qué necesitamos cristales para ver difracción? Amplificación de la señal ….(efecto de interferencia a tener en cuenta!) molécula celda unidad cristal

Difracción: Cada electrón dispersa Las ondas emitidas se suman … y se restan!! El resultado final depende de las fases relativas de las ondas adicionadas en cada dirección Ley de Bragg : n= 2d sin  Usar el sitio interactivo http://www.journey.sunysb.edu/ProjectJava/Bragg/home.html