cuantificación de microorganismos Curva de crecimiento de Escherichia coli: cuantificación de microorganismos EQUIPO 1

Crecimiento de poblaciones Crecimiento: aumento en el número de células microbianas de una población. Incremento de masa celular. Velocidad de crecimiento: cambio en el número de células o en la masa celular por unidad de tiempo Generación: intervalo para la formación de dos células a partir de una Tiempo de generación: tiempo transcurrido para que esto ocurra

Curva de crecimiento Típica de un sistema cerrado ó cultivo en medio no renovado ó cultivo monofásico:

Fase de latencia (Fase lag) Fase en la que el crecimiento se da tras un periodo de tiempo Puede ser breve o larga Si se inocula en el mismo medio y condiciones de cultivo, no hay retraso y el crecimiento exponencial inicia rápido Si el inóculo se toma de un cultivo viejo (fase estacionaria) o las células han sido dañadas hay retraso También ocurre cuando se transfiere un cultivo de un medio rico a uno mas pobre

Fase exponencial Consecuencia de que cada célula se divide para formar dos Las células están en el estado fisiológico más sano La mayoría de los mo unicelulares tienen este crecimiento Las velocidades son muy variables y están influenciadas por condiciones ambientales y características genéticas del mo

Fase estacionaria En un sistema de cultivo cerrado por ejemplo tubo o matraz, el crecimiento exponencial no puede ser indefinido ya que: 1.- Un nutriente esencial del medio se usa y llega a ser un factor limitante del crecimiento 2.- Se acumulan en el medio productos de desecho No hay aumento ni descenso neto en el número de células Funciones celulares continúan Crecimiento críptico: algunas células crecen y otras mueren equilibrándose

Fase de muerte Si la incubación continúa Menos células vivas y metabólicamente activas Más células que mueren Hay lisis celular real La velocidad de muerte es exponencial pero mucho más lenta que la de crecimiento

Métodos de cuantificación de microorganismos El crecimiento de poblaciones se mide estimando los cambios en el número de células, en la cantidad de algún componente de las mismas o en el peso total seco de las células DIRECTOS Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter) Se hace pasar una suspensión microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 m diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula). Cámaras de recuento

Recuento de células totales: Contando una muestra con el microscopio en muestras secas o líquidas.

Ventajas: -Método rápido Desventajas: -No distingue células vivas de muertas -Células pequeñas no se ven -La precisión es difícil -Se requiere microscopio de contraste de fases cuando la muestra no se tiñe - No adecuado para baja densidad celular

Recuento de células viables

Métodos de cuantificación de microorganismos INDIRECTOS Turbidez (Turbidimetría) Método rápido y útil para obtener estimaciones del número de células Se debe a que las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión Se mide con fotómetro o espectrofotómetro Estos miden la luz no dispersada Las lecturas se expresan en unidades fotométricas (fotómetro) o de densidad óptica para el espectrofotómetro

Se obtiene una curva estándar donde se puede observar que las UDO son proporcionales al número de células Se debe preparar para cada microorganismo a estudiar una curva estándar Se pueden hacer sin destruir o modificar la muestra Se usan mucho para seguir la velocidad de crecimiento La misma muestra puede medirse repetidamente

Escherichia Coli Bacilo Gram negativo Anaerobio facultativo Móvil por flagelos perítricos No forma esporas Capaz de fermentar glucosa y lactosa Bacteria muy utilizada en experimentos de genética y biotecnología molecular.

Curva de crecimiento de E. coli

Fuentes de información Jesús Ramírez Santos,* Gabriel Contreras Ferrat,** M. Carmen Gómez Eichelmann. “Revista Lationoamericana de Microbiología”. Vol. 47, No. 3-4 July - September. 2005, October - December. 2005 pp. 92 -101 www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-2005/mi05-3_4f.pdf Ciclo celular y crecimiento. “Microbiología” Universidad de Granada. http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm Mandigan, Martinko, Parker, 2004. Brock Microbiologia. 10ª Ed. Pearson, Madird, España.

Procedimiento

Práctica # 6 "Curva de crecimiento de Escherichia coli: cuantificación de microorganismos”

MATERIAL Sesión extra clase Sesión práctica 4 15 Tubos de rosca 5 Pipetas de 1 mL 5 Pipetas de 10 mL 1Cilindro para esterilizar pipetas 1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL 1 Parrilla Agitadores magnéticos 1 Vaso de precipitados 1000 mL 1 probeta de 100 mL Balanza analítica Gasa Algodón Papel de estraza REACTIVO Caldo nutritivo Agua destilada Celdas para espectrofotómetro Espectrofotómetro Microscopio óptico Portaobjetos Cámara de Neubauer Cubreobjetos 2 Mecheros Fisher 1 tubo “t” de vidrio 4

METODOLOGÍA 2 Sesión extra clase 1 Esterilizar Autoclave a 15 lb/plg2, durante 15 minutos. 2 Esterilizar Sesión extra clase 15 X 4 =60 Pipetas Tubos con tapón de rosca Matraz Erlenmeyer de 125 mL • 10 mL del medio en un tubo con tapón de rosca (15 tubos) 1 Pipetas limpias con tapón de algodón y en el cilindro Parcialmente cerrados Con tapón de algodón 250 mL de Caldo nutritivo • 50 mL del medio en un matraz Erlenmeyer de 125 ml con tapón de algodón 4 g caldo en 250 mL de agua destilada g X 4 = En 1000 mL

Se agregó cierta cantidad del matraz A Inocular con Escherichia coli el 2 matraz Erlenmeyer (A y B) un día anterior a la sesión práctica (19 de mayo de 2008, a las 17:00 hrs)e incubar a 37ºC. 3 Con asada de un cultivo puro Se agregó cierta cantidad del matraz A 4 Inocular con el cultivo del matraz A a otro matraz con caldo nutritivo e incubar a 37ºC 20 de mayo a las 11:00 hrs Sesión práctica medir densidad óptica de cada tubo y realizar conteo de células 5

Fecha de inoculación Hora de inoculación Tubo o Matraz Minutos de incubación Hora de checar Equipo encargado de checar 19 mayo 17:00 2 matraces: A y B 1380 16:00 1 20 mayo 11:00 Del matraz A: 1 matraz 270 15:30 13:00 240 X 14:00 Del matraz A: 2 tubos 210 17:30 4 Del matraz B: 14 tubos Eq 2: 4 tubos Eq 3: 6 tubos Eq 4: 4 tubos No se checa 2 Esterilizar 30 X 3 60 16:30 90 120 150 18:00 180 18:30 Matraz (11:00) 420 Matraz (13:00) 330 Matraz (11:00) 480 6:30

Densidad Óptica Conteo de Células Bajo condiciones de asepsia colocar en el área hundida de la cámara de Neubauer una gota de los cultivos (muestras series 1 y 2 según sea el caso) y extenderla rápidamente. Colocar el cubreobjetos y observar con los objetivos de 40X y 100X Contar las células en cuadros individuales. Calibrar espectrofotómetro utilizando como blanco medio estéril. En una celdilla limpia agregar cierta cantidad de la muestra (tratando de mantener limpia la celdilla). Poner en el espectrofotómetro y leer su densidad óptica. Cuadro 1= 5 Cuadro 2= 6 Cuadro 3 = 5 Cuadro 4= 5 Cuadro 5= Cuadro 6= Cuadro 7= Cuadro 8= Cuadro 9= Cuadro 10=

7 Cálculo del número de microorganismos por mililitro o gramo de la muestra original 7

tiempo Absorbancia 30 0.024 0.017 60 0.025 0.027 90 0.016 0.018 120 0.021 150 0.02 180 0.022 0.015 210 0.033 0.026 270 0.083 0.078 420 0.13 0.14 480 0.149 1380 0.236

tiempo Ln 30 -3.72970145 -4.07454193 60 -3.68887945 -3.61191841 90 -4.13516656 -4.01738352 120 -3.86323284 150 -3.91202301 180 -3.81671283 -4.19970508 210 -3.41124772 -3.64965874 270 -2.48891467 -2.55104645 420 -2.04022083 -1.96611286 480 -1.90380897 1380 -1.44392347 -1.44816976

tiempo conteo de células 0.00000001 30 2.35E+05 60 5.00E+04 120 3.96E+05 150 7.92E+04 210 8.92E+04 270 4.28E+05 420 3.36E+05 480 7.20E+06 1380 1.02E+07

tiempo segundos) Ln 150 11.2797316 210 11.3986363 270 12.9668785 420 12.7248664 480 15.7895916 1380 16.1378983