COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP El grupo Coliforme queda definido como los bacilos Gram negativos aerobios o anaerobios facultativos , no esporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas en un tiempo máximo de 48hs a 35 ± 05°C Los datos son reportados en términos de NMP de organismos presentes. Basados en fórmulas de probabilidad da una estimación de la densidad media de Coliformes presentes en la muestra, que puede representarse como: NMP = µ + e m + e a Donde µ es la verdadera cc promedio de la masa de agua, em error de estimación debido al muestreo y ea el error debido a la determinación analítica La precisión dependerá del número de tubos usados. Cuando se aplica a calidad de agua de bebida se recomienda el uso de réplicas de 10 tubos con 10ml de muestra, 5 tubos con 20ml de muestra o bien, un sólo frasco con 100ml

COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP Las réplicas de tubos a sembrar se definen de acuerdo a la precisión, límites de detección requeridos y sospecha de contaminación bacteriana de la muestra: Para agua cruda superficial, líquido residual cloacal, biosólidos se siembran tripletes de tubos de 1ml de diluciones decimales seriadas de la muestra En caso de muestras de lagos, vertientes donde se presumen recuentos bacterianos más bajos se siembran réplicas de 5 tubos de 1ml de diluciones seriadas de la muestra La densidad de Coliformes se expresa en términos de NMP (NMP/100ml), en el caso de biosólidos se expresa como NMP / gramo de materia seca 2

COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP El test comprende tres etapas: presuntiva, confirmatoria y completa. Todos los tubos positivos que presenten crecimiento con producción de ácido y/o gas pasarán a la fase confirmatoria. El test completo se aplicará a no menos del 10% de las muestras positivas de un trimestre.

COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP Etapa presuntiva: se siembran en caldo Lauril sulfato-triptosa (LTB), luego del período de incubación se revisan los tubos por presencia de ácido y/o gas Todos los tubos positivos pasarán a la fase confirmatoria: de cada tubo efectuar repiques a tubos con caldo Lauril sulfato-triptosa (LTB) para confirmación de Coliformes totales y a tubos con caldo EC-triptófano para diferenciación y confirmación de Escherichia coli

COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP

COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP Caldo Lauril Triptosa (+) Caldo Bilis Verde Brillante (+) Caldo EC (+) producción de ácido y/o gas producción de gas Indol (+) (48 ± 3hs a 35 ± 0.5°C) (48 ± 3hs a 35 ± 0.5°C) (24 ± 2hs a 44.5 ± 0.2 °C) Coliformes totales Coliformes totales Escherichia coli Presuntivos Confirmados Confirmada

COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP

COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP N° tubos positivos 3 tubos seriados de 1ml NMP /100ml 5 tubos seriados de 1ml 5 tubos de 20ml 10 tubos de 10ml 1 40 20 <1.1 1.1 11 70 3 3.6 2 90 50 2.6 5 6.9 333 24000 555 4.6 7 12 3332 110000 5552 54200 4 8.0 9 23 33333 2400000 55555 >8.0 10 >23

METODO DE PRESENCIA / AUSENCIA Es una simplificación del test de NMP que usa una sola porción de 100ml para obtener información cualitativa Puede ser usado como base cualitativa de otros indicadores: Clostridios, Pseudomonas, Coliformes Termotolerantes En el caso de Coliformes consta de una fase presuntiva donde se siembran 100ml de muestra de caldo P/A (triple concentración) Luego de la incubación las condiciones de acidez por fermentación de la lactosa da un color amarillo distintivo y por agitación el gas produce espuma La fase confirmatoria incluye confirmación para Coliformes totales, fecales y E coli Los resultados se reportan como test P/A positivo o negativo por 100 ml de muestra Cuando una muestra da positiva es recomendable determinar las densidades de Coliformes en repeticiones para obtener información de la magnitud del evento

COLIFORMES TOTALES: MEMBRANA FILTRANTE A los fines de esta técnica el grupo Coliforme se define como bacilos Gram negativos aerobios o anaerobios facultativos , no esporulados que producen aldehídos de la fermentación de la lactosa y brillo metálico en la superficie de las colonias Membranas: lámina rígida , uniforme de material polimérico (acetato o nitrato de celulosa) con un tamaño de poro determinado (en general,0.45 u) que retiene partículas en su superficie Ventajas: es altamente reproducible, puede ser usada para procesar grandes volúmenes de agua dando resultados numéricos en menor tiempo que el NMP Limitaciones: muestras de agua con alto contenido de material particulado, la retención de partículas está limitada a la superficie del filtro, altas densidades de bacterias no-Coliformes que pueden interferir con el máximo desarrollo de Coliformes Incubación: 22 a 24hs a 35 ± 0.5 °C La diferenciación de algunas colonias puede perderse si se incuba más de 24hs

COLIFORMES TOTALES: MEMBRANA FILTRANTE Confirmación/ Verificación: para agua de bebida verificar como mínimo 5 colonias típicas y 5 atípicas de muestras positivas, en caso de no obtener positivos analizar una muestra positiva de origen conocido trimestralmente Test confirmatorio: gas a partir de LTB y BGLB (35±0.5°C, 48hs) La inoculación en caldo EC (44.5±0.2°C, 24hs) revela la presencia de Coliformes Termotolerantes y el EC-MUG(44.5±0.2°C, 24hs) la presencia de E coli Test verificación rápidos: citocromo oxidasa(-)y ß galactosidasa o sistemas multi-test para Enterobacterias Cálculo y expresión de resultados: computar recuentos entre 20-80 colonias y no más de 200 colonias. Medios de cultivo: m-ENDO Agar Les o m-ENDO Broth, Tergitol-7, Coli ID, Chromocult Agar, m-Lauril Sulfato Broth, Cahpman TTC Agar

METODO DE PARTICION PARA E COLI Un método rápido es pasar la membrana con Coliformes totales o fecales a un agar nutritivo con el sustrato MUG En este caso E coli se define como el Coliforme que produce la enzima ß-glucuronidasa e hidroliza el sustrato MUG (4-metil umbeliferil-B-D-glucurónido) para producir fluorescencia azulada alrededor de la colonia La incubación se realiza a 35 ± 0.5 °C durante 4hs y se observan las colonias fluorescentes bajo lámpara UV (366nm) Se puede optar por caldo EC-MUG (44.5 ± 0.2°C,24hs) y observar la fluorescencia bajo lámpara UV Agregar un control de medio de cultivo por autofluorescencia y un control positivo (E coli, MUG +) y uno negativo (Klebsiella penumoniae, MUG-)

Técnica de tubos múltiples Técnica de Filtración por membrana Comparación de dos métodos de ensayo más utilizados en la vigilancia de la calidad microbiológica del agua Técnica de tubos múltiples Técnica de Filtración por membrana Más lenta, requiere 48 horas para observar la positividad Más rápida, resultados cuantitativos o presuntivos alrededor de 8 horas. Más laborioso Menos laborioso Requiere más medio de cultivo. Requiere menos medio de cultivo Requiere más cristalería Requiere menos cristalería Menos sensible Más sensible Los resultados son obtenidos indirectamente por aproximación estadística (baja precisión) Los resultados son obtenidos directamente por conteo de colonias (alta precisión) No se puede adaptar a trabajo de campo Capaz de ser adaptado en el campo Aplicable a todo tipo de agua No es aplicable a aguas turbias Los recursos están disponibles en la mayoría de los países El costo de los recursos es alto en algunos países Podría ser mejor la recuperación de -microorganismos dañados o estresados en algunas circunstancias Para recuperación de organismos estresados se usan medios de resucitación

COLIFORMES TOTALES: MEMBRANA FILTRANTE Agar m-ENDO Les Coliformes Totales Agar Nutritivo + MUG Lámpara UV Escherichia coli

RECUENTO DE MICROORGANISMOS VIABLES El recuento en placa de las bacterias con incubación aeróbica a 22 y 37°C representa el número de bacterias totales seleccionadas según: el medio de cultivo, temperatura y tiempo de incubación. ISO 6222: propone la supresión de glucosa del medio de cultivo (medio menos rico en nutrientes) y modifica las condiciones de incubación: 36± 2°C (44±4hs) y 22± 2°C (68± 4hs) IRAM 29122: traducción de la ISO 6222 SM 9215 B: plantea el uso de PCA (altos nutrientes) sólo para comparaciones o continuidad con los datos antiguos ya adquiridos y recomienda el uso del R2A o HPCA agar. Incubación: 48hs a 35°C

PSEUDOMONAS AERUGINOSA: METODOS Membrana filtrante: SM 9213 E propone el uso del M-PA-C agar, incubación a 41.5±0.5°C por 72hs y confirmación en Milk Agar (35±1.0°C, 24hs) de un número de colonias típicas y atípicas La norma francesa NFT 90-421 propone el Agar Cetrimida suplementado con ácido nalidíxico como medio selectivo (37±1°C, 48±3hs) y observación de fluorescencia (por la producción de un pigmento azul-verdoso fluorescente) bajo lámpara UV. Confirmación crecimiento en Agar Nutritivo (42±0.5°C, 24hs) Método por NMP: SM 9213F propone el uso del caldo Asparagina (35 a 37°C, 24 a 36hs) para la etapa de enriquecimiento y caldo Acetamida (35 a 37°C, 24 a 36 hs) para la etapa de confirmación

ENTEROCOCOS: METODOS Membrana filtrante: NF EN ISO 7899-2, emplea el medio de Slanetz Bartley (37±1°C,48±3hs) que contiene azida de sodio y reduce el cloruro de trifenil-2,3,5- tetrazolium a formazán (coloración roja) y confirmación por transferencia de la membrana en forma invertida en agar BEA (azida bilis esculina) (44 ± 0.5°C, 30min) dando colonias negras por hidrólisis de la esculina Medios de cultivo: m-Enterococcus agar, KF Estreptococcus agar, D-coccosel, Chromocult Enterococos agar Por NMP: NFT-90-411, enriquecimiento en caldo azida dextrosa (37±1°C, 24-48hs) y confirmación en agar bilis esculina (37±1°C, 24-48hs) Medios de cultivo: Caldo Azida Dextrosa, Caldo Rothe, Caldo EVA, Caldo Azida Glucosa

ENTEROCOCOS: METODOS Agar Chromocult m-Enterococos Agar

CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES: METODOS Membrana filtrante: ISO 6461/2, eliminación de las formas vegetativas por calentamiento en baño de agua a (75± 5°C, 15 min), filtración por membrana de 0.2µm ,para aguas contaminadas filtrar 10ml y ajustar diluciones. Incubar en condiciones de anaerobiosis (37±1°C, 20±4hs y 44±4hs), si esto no es posible informar resultados de (20±4)hs, se observarán colonias con halo negro por reducción del sulfito de sodio a sulfuro y combinación con la sal de hierro (citrato de hierro) Medios de cultivo: SPS agar, m-CP agar, TSC agar, Triptosa Sulfito Cicloserina agar, Sulfito Iron Base agar Por NMP: EN 26461/1, calentamiento por 15 min de la muestra y enriquecimiento en caldo DRCM (Diferential Reinforced Clostridial Broth)y anaerobiosis por agregado de capa de vaselina al tubo, incubar (37±1°C, 44±4hs) se consideran positivos los tubos con precipitado negro.

CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES: METODOS NMP: Caldo DRCM Membrana filtrante: Agar SPS

Métodos Enzimáticos para la detección de Indicadores Utiliza los sustratos hidrolizables para la detección simultánea de enzimas de E. coli y Coliformes totales y también Enterococos Disponibles en formato P/A, NMP o en multiplaca. Según el principio que utilice será la coloración final del reactivo : Enterolert®, IDEXX (Manafi, 1996), Colisure®, IDEXX (Mc Feters, 1995) Colilert®, IDEXX (Edberg, 1991 y 1998), m-Coliblue®, Hach ColiComplete®,BioControl Chromocult®, MerckMicroSure®, Gelman, Colifast Coliformes Totales Reactivo + Escherichia Muestra coli

Sustancia cromogénica Sustancias Cromogénicas disponibles para la detección de bacterias indicadoras Bacteria Sustancia cromogénica Enzima testeada Coliformes o-nitrofenil-ß-D-galactopiranósido (ONPG) 6-bromo-2-naftil-ß-D-galactopiranósido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactopiranósido (XGAL) ß-D- galactosidasa E coli 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-glucurónido (XGLUC) 4-metilumberlliferil-ß-D-glucurónido (MUG) ß-D- glucuronidasa Enterococos 4-metilumberlliferil-ß-D-glucósido (MUD) indoxil-ß-D-glucósido ß-D- glucosidasa Fuente: Adaptado de Manafi (1996)