EFECTOS DEL PESTICIDA FLUTRIAFOL SOBRE LA LIBERACION IN VIVO DE DOPAMINA EN EL NÚCLEO ESTRIADO DE RATAS. UN ESTUDIO MEDIANTE MICRODIALISIS CEREBRAL. Profa. Dra. Lilian Rosana Ferreira Faro

Pesticidas Definición Los pesticidas o plaguicidas son sustancias químicas destinadas a matar, repeler, atraer, regular o interrumpir el crecimiento de plagas en su sentido mas amplio. Consideramos plaga a aquellos organismos nocivos que transmiten enfermedades, compiten por alimentos y/o dañan bienes económicos y culturales.

Pesticidas. Tóxicos en potencia. Los pesticidas poseen dos características que les hacen interesantes para el estudio desde el punto de vista de la salud: Son biocidas: compuestos químicos destinados a eliminar organismos interfiriendo en mecanismos vitales que son comunes a la mayoria de los seres vivos, incluidos los humanos. Uso muy extendido: por lo que parece dificil sustraerse a su contacto.

Uso de plaguicidas en España Existe una gran cuantidad de productos usados como pesticidas en el mundo. En España, hay unos 500 ingredientes activos y unos 5000 productos comerciales.

Uso de plaguicidas en España Gasto en 2003: 650 millones de Euros Cuantidad utilizada: 112.000 Tm Los más utilizados: Fungicidas: 28% Herbicidas: 25% Insecticidas: 20%

CLASIFICACIÓN DE LOS PESTICIDAS A. SEGUN EL TIPO DE ORGANISMO QUE COMBATEN. B. SEGUN SU FAMILIA QUIMICA. C. SEGUN SU TOXICIDAD AGUDA.

En cuanto a la toxicidad... Extremamente tóxico Altamente tóxico Medianamente tóxico Poco tóxico Muy poco tóxico

Características químicas En cuanto al grupo químico Grupo Características químicas Organofosforados Compuestos orgánicos devivados del ácido fosfórico, tiofosfórico o ditofosfórico. Ex.: paration, malation... Carbamatos Ésteres derivados de los ácidos n-metil o dimetil carbámico. Ex.: carbaril, furadan. Organoclorados Compuestos a base de carbono, con radicales de cloro. Son derivados del ciclobenzeno, ciclohexano o ciclodieno. Ex.: DDT, lindano, endosulfan Ditiocarbamatos Carbamatos que contienen, cuasi siempre, un metal en su estructura química. Ex.: maneb, zineb, mancozeb. Dipiridilos Herbicidas sólidos, insípidos e inodoros muy solubles en agua. Ex.: paraquat Piretroides Compuestos sintéticos que presentan estructuras parecidas a la piretrina, sustancia existente en las flores del crisantemo. Ex.: aletrina, dismetrina, Neonicotinoides Compuestos que presentan estructura química parecida a la nicotina, con efecto biológico similar a esta. Ex.: Tiametoxam.

Tipo de Pesticida Acaricida Antimicrobiano Avicida Fungicida Herbicida En cuanto al organismo que combaten Tipo de Pesticida Acaricida Antimicrobiano Avicida Fungicida Herbicida Inseticida Moluscicida Piscicida Rodenticidas Raticida

Insecticidas Fungicidas Organoclorados Organoclorados CLASIFICACION DE LOS PESTICIDAS Insecticidas Fungicidas Organoclorados Organoclorados Organofosforados Organo mercuriais Carbamatos Triazoles Piretroides Ditiocarbamatos Herbicidas Raticidas Bipiridilos Dicumarínicos Organoclorados Triazinas Acaricidas / Sarnicidas Piretroides

Toxicidad de los pesticidas

DDT Organoclorados Ex.: DDT, Lindano, Dicofol Persisten en el ambiente  POPs Estimulantes del SNC, siendo sus efectos manifestados principalmente por convulsiones. Otros signos: Parestesia, agitación involuntaria, ataxia y hiperreflexia. Estos signos pueden ser consecuencia de efectos a nivel molecular tales como: Aumento de la concentración de amonio libre Disminución de los niveles de GABA y de la concentración de acetilcolina

Organofosforados y Carbamatos Toxicidad de los pesticidas Organofosforados y Carbamatos Muy tóxicos, usados principalmente como insecticidas. Organofosforados Carbamatos Irreversible Reversible Colinesterasas (ChEs) Alteración Colinérgica (Taylor, 1985 )

Principales síntomas de la intoxicación por Organofosforados y Carbamatos Cansacio Dolor de cabeza Mareos Sudoresis Visión borrosa Vómito Calambres Dolor de estómago

Paraquat Produce degeneración de las neuronas dopaminérgicas nigro-estriatales en animales experimentales. Estimula la liberación de glutamato y toda la cascada que lleva a la produción de especies reactivas al oxígeno. Glutamato  Receptores no NMDA  entrada de Ca++  activación de la NOS  Óxido nítrico  ROS

EFECTOS AGUDOS EXPOSICION HUMANA Y EFECTOS TOXICOS Excitabilidad; Polineuropatia periférica; Vertigo; Sudoresis; Dolor de cabeza; Constricción de la Pupila; Mareo, Vómito y Diarrea; Salivación; Ataxia; Latidos Cardiacos alterados; Parestesia; Broncoespasmo; Convulsión; Coma. Alavanja, 2004

? EFECTOS CRONICOS EXPOSICION HUMANA Y EFECTOS TOXICOS Alteraciones de Humor; Esquizofrenia; Desordenes Afectivas; ? Déficits en actividades neurocomportamentales; Alteraciones en la función sensorial; Enfermedad de Alzheimer; Enfermedad de Parkinson. Alteración en la función motora; Depresión; Disminución de la Cognición; Alavanja, 2004

ENFERMEDAD DE PARKINSON Degeneración Nigroestriatal; PARAQUAT; Alteración en la actividad motora; MANEB; Terminales dopaminérgicas alteradas; ROTENONA; DIELDRIN; Reducción de la actividad mitocondrial; HEPATOCLOR; DDT y metabolitos. Muerte de las células dopaminérgicas.

Neurotransmisión dopaminérgica Caudado-Putamen Córtex Pré-Frontal Núcleo Acumbens Tubérculo Olfatório

Haz prosencefálico medial Amígdala Substância Negra Hipo-campo Núcleo Caudado Putamen Giro Cingulado Núcleo Accumbens Hipotálamo

FISIOLOGIA DE LA TERMINAL DOPAMINERGICA Tyr DOPAC extracelular DOPA DOPAC DA COMT MAO HVA HVA Compartimento Citoplasmático MAO COMT 3MT

Insecticidas Fungicidas Organoclorados Organoclorados CLASSIFICACION DE LOS PESTICIDAS Insecticidas Fungicidas Organoclorados Organoclorados Organofosforados Organo mercuriais Carbamatos Triazoles Piretróides Ditiocarbamatos Herbicidas Raticidas Bipiridilos Dicumarínicos Organoclorados Triazinas Acaricidas / Sarnicidas Piretroides

TRIAZOLES TRIADIMEFON VORICONAZOL FLUTRIAFOL CLOTRIMAZOL TEBUCONAZOL FLUCONAZOL

DÉFICIT DE APRENDIZAJE (PERDIDA DE CÉLULAS HIPOCAMPALES) EFECTOS NEUROTOXICOS DE LA EXPOSICION A LOS TRIAZOLES RATAS TRIADIMEFON HIPERACTIVIDAD; COMPORTAMIENTOS ESTERIOTIPADOS; FASE EMBRIONARIA TEBUCONAZOL AUTO-MUTILACION. FLUTRIAFOL ? DÉFICIT DE APRENDIZAJE (PERDIDA DE CÉLULAS HIPOCAMPALES) Crofton, 1996; Moser, 2001

OBJETIVOS DE ESTE TRABAJO Estudiar los efectos de la administración del pesticida flutriafol sobre la liberación in vivo de dopamina en el núcleo estriado de ratas utilizando la técnica de Microdialisis Cerebral acoplada a la Cromatografia Líquida de Alta Eficacia (HPLC) con detección electroquímica.

Materiales y Métodos Microdialisis cerebral Cromatografia Líquida de Alta Eficacia (HPLC)

Microdialisis Local de implantación de la sonda Proceso de microdialisis

Sonda de microdialisis

HPLC

Sistema de microdialisis y HPLC

A - DOPAC B - Dopamina C - 5-HIA D - HVA Valores basales DA = 0.41  0.19 ng/ 20 min

Protocolo de administración in situ de flutriafol Medio Ringer Flutriafol 60 min Flutriafol 1 mM 6,6 mM 12 mM

POSIBLE MECANISMO DE ACCION DEL FLUTRIAFOL PARA INDUCIR LA LIBERACION DE DOPAMINA HIPÓTESIS: Tyr 1 - Aumento exocitótico de la liberación de DA DOPA DA Flutriafol

MECANISMO DE ACCION DEL FLUTRIAFOL PARA INDUCIR LA LIBERACION DE DOPAMINA HIPÓTESIS: Tyr 2 – Alteración de la actividad del DAT DOPA DA Flutriafol x

Grupos experimentales Administración de medio libre de calcio Administración de medio libre de sodio Administración de TTX Administración de reserpina Administración de nomifensina

P.A. Administración de medio libre de calcio o de sodio Tyr Na+ Ca++ DOPA DA Na+ Ca++ Ca++

Medio Ringer sin Calcio o sin sodio CARACTERIZACION DE LA LIBERACION ESTRIATAL DE DOPAMINA Medio Ringer sin Calcio o sin sodio 20 min Medio Ringer Sin calcio Sin sodio 60 min 6,6 mM Flutriafol + Ringer sin Calcio

S/ Ca++ 92%

S/ Na+ 70%

Administración de TTX P.A. Tyr TTX DOPA DA X Na+

Animales tratados con 10 µM TTX 20 min Medio Ringer Medio Ringer com TTX 6,6 mM Flutriafol + TTX 60 min

TTX 73%

Administración de Reserpina Tyr RESERPINA DOPA DA x DA

Animales tratados con 10 mg/Kg i.p. de Reserpina 20 min 6,6 mM Flutriafol Medio Ringer 80 min 60 min Reserpina i.p.

RESP. 86%

Administración de Nomifensina Tyr NOMIFENSINA DOPA DA x

20 µM Nomifensina + 6,6 mM Flutriafol Tratamiento con 20 µM Nomifensina y 6,6 mM de Flutriafol 20 min 20 µM Nomifensina + 6,6 mM Flutriafol Meio Ringer 60 min Medio Ringer

NOM

Tyr FLUTRIAFOL DOPA DA Na+ Ca++ TTX

Pré-tratamento RESERPINA 10mg/Kg Tyr FLUTRIAFOL DOPA DA

Tyr FLUTRIAFOL DOPA DA NOMIFENSINA

CONCLUSIONES 1. La infusión intraestriatal de diferentes concentraciones de flutriafol aumenta los niveles extracelulares de dopamina de manera dependiente de la concentración utilizada. Estos son los primeros resultados que demuestran la acción de ese fungicida sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado. 3. La liberación de dopamina inducida por flutriafol es mediada por un mecanismo exocitótico dependiente de calcio, sodio, inhibido por TTX y dependiente de la dopamina vesicular. 4. La liberación de dopamina inducida por flutriafol no es mediada por una acción sobre el transportador de dopamina, una vez que este fungicida no ha alterado los efectos producidos por la nomifensina.