PRÁCTICO N° 2 Técnicas para la observación, aislamiento y conservación de microorganismos Objetivo: Adquirir habilidad para el manejo de colorantes, microscopio, condiciones de asepsia y métodos de aislamiento Métodos de coloración y observación de microorganismos Manejo en condiciones de asepsia Obtención de cultivos puros Conservación de cultivos puros

Síntesis del práctico anterior Laboratorio Práctico 1 Práctico 2 Esterilización Medio de cultivo Observación Aislamiento Autoclave - horno Radiación Filtración Composición química Preparación de medios Productos químicos • Fuente de energía/carbono Líquidos Sólidos • Base mineral • Agua • Pesar drogas • Pesar drogas • Disolver con agua destilada • Disolver con agua destilada • Regular pH • Regular pH • Fraccionar • Agarizar • Fundir • Fraccionar Esterilización en autoclave Siembra de suelo Incubación

Métodos de coloración y observación de microorganismos Características del microscopio óptico Aumento: objetivo x ocular Resolución: objetivo de inmersión (aceite de inmersión) Tipos de microscopios Campo claro Contraste de fases Campo oscuro Fluorescencia

Métodos de coloración Objetivo: Aumentar el contraste de los microorganismos con el fondo Tipos de coloración: Simples (un solo colorante) Dobles (dos colorantes, coloraciones diferenciales) Colorantes más utilizados: Safranina Azul de metileno Fucsina Cristal violeta Azul de algodón

Secuencia de una coloración Preparación y fijación de un extendido por calor Coloración Observación

Coloración de Gram 1) Teñir el extendido con Cristal Violeta (1 minuto) Todas las bacterias se tiñen de violeta 2) Añadir Lugol para fijar el colorante (1minuto) 3) Decolorar con alcohol Las bacterias G + quedan violetas y las G – se decoloran 4) Teñir con fucsina (30 segundos) Las bacterias G + quedan violetas y las G – rosadas

Flamear un portaobjeto Secuencia de una coloración Equipo de coloración Flamear un portaobjeto Esterilizar el ansa Extender Fijar al calor Extraer una alícuota

Secuencia de una coloración (cont.) Agregar el colorante Esperar un minuto Lavar Secar Observar

Secuencia de fijación con ácido y coloración Portaobjeto enterrado Colorear con fucsina Esperar 5 ?? minutos Fijación con ácido acético

Manejo en condiciones de asepsia Atmósfera: cámara de flujo, lámpara UV Superficie de la mesa de trabajo: alcohol, hipoclorito Obtención del material: ansa estéril Flameado de recipiente

Obtención de cultivos puros Cultivo puro: cultivo de microorganismos genéticamente iguales. Aislamiento: Método para obtener un cultivo puro. Métodos de aislamiento Aislamiento en medio sólido: Consiste en separar e inmovilizar individuos en un medio solidificado. Aislamiento biológico: Consiste en inocular animales o vegetales y aislarlas de la sangre, tejidos, etc.

Obtención de cultivos puros Aislamiento en medio sólido por estriado Colocar en caja de Petri Dejar solidificar Fundir el agar Esterilizar el ansa Trazar estrías sobre el agar Incubar

Obtención de cultivos puros Colonias aisladas Crecimiento confluente Cultivos puros en caja de Petri

Conservación de cultivos puros Formas de conservación de cultivos puros Liofilización: desecación mas congelación Congelación: -90° C recubierto con glicerol Subcultivos seriados: repiques periódicos ( 4-5°C)

Síntesis del práctico N° 2 Técnicas microbiológicas Normas de manejo en microbiología Observación Microscopio Óptico Tipos: Campo Claro Contraste de Fase Campo Oscuro Florescencia Coloración tipos Simples Dobles Aislamiento Conservación Asepsia Medio sólido (estrías) Biológico (vegetales o animales) Liofilización Congelación Subcultivos seriados Atmósfera Sup. de trabajo Manejo de material y recipiente

Actividades Coloración simple: colorear con fucsina los cultivos de suelo (fijado por calor) y el portaobjeto enterrado (fijado con ácido acético) Coloración doble: observar al microscopio bacterias Gram + y Gram – Aislamiento: observar estrías crecidas en caja de Petri

Coloración doble (Gram) Bacterias G- Bacterias G+

Coloración simple (Rossy-Cholodny) Hongo tabicado Partícula de arena Bacterias Actinomycetes Hongos

Taxonomía bacteriana Concepto de especie y cepa Nomenclatura binomial. Ej. Escherichia coli Metodología Convencional: claves dicótomicas Molecular: coeficiente de similitud genética Caracteres morfológicos: forma, tamaño, presencia de esporas, carácter Gram, flagelación, capsulas, etc. Composición de bases del ADN Caracteres metabólicos: heterótrofos, fotótrofos, aeróbicos, anaeróbicos, etc. Secuenciación de nucleótidos Otros: condiciones ambientales, hábitat, patogeneidad, Hibridación del ADN

Taxonomía convencional: Manual Bergeys: Claves dicotómicas

Taxonomía molecular: Dendrogramas de coeficientes de similitud genética Rangos de similitud: 99 – 100 %: misma cepa >60%: misma especie >20%: mismo género