Árbol de la Biotecnología

¿Cuál es la relación entre Biotecnología y la Genética? La Biotecnología moderna considera la aplicación comercial de organismos vivos y sus productos, a través de la manipulación deliberada de sus moléculas de ADN y genes mediante ingeniería genética.

Animales y plantas transgénicos Aplicaciones de Ingeniería genética para biotecnología Proteínas recombinantes Modificación genética de vías metabólicas Terapia génica Ingeniería genética Animales y plantas transgénicos vacunas

Temario general Bases moleculares de la genética Técnicas de Ingeniería Genética Aplicaciones de Ingeniería Genética

Proceso de expresión de los genes = información = mensaje = función

CONCEPTO MOLECULAR DE GEN Promotor Terminador Gen DNA RNA polimerasa mRNA polipéptido

Existen 20 aminoácidos naturales que forman las proteínas

mRNA (AGGCUUAGACCGAGU, etc) Proteínas (Ala-Met-Tyr Trp-Phe-Leu, etc) ¡ TRADUCCION USANDO EL CODIGO GENETICO ! Proteínas (Ala-Met-Tyr Trp-Phe-Leu, etc)

OPERÓN BACTERIANO Conjunto de genes vecinos y que se transcriben juntos, bajo la orden de un promotor. Todos los genes de un operón participan en una misma vía metabólica. Por ejemplo, genes del operón lactosa (codifican para enzimas de la degradación del azúcar lactosa).

Operón bacteriano -galactosidasa permeasa acetilasa promotor RNA polimerasa promotor terminador Gen 1 gen 2 gen 3 1 solo mRNA -galactosidasa permeasa acetilasa Tres proteínas diferentes que participan en la degradación del azúcar lactosa

Genes de eucariontes son interrumpidos por secuencias no codificantes (intrones) Transcripción mRNA maduro

PROCESO DE EXPRESIÓN GÉNICA: DIFERENCIAS ENTRE PROCARIONTES Y EUCARIONTES

PROCESO DE EXPRESIÓN GÉNICA: DIFERENCIAS ENTRE PROCARIONTES Y EUCARIONTES Transcripción nuclear y traducción citoplasmática Transcripción y traducción separadas en el tiempo Genes individuales Genes interrumpidos por intrones Procariontes Transcripcion y traducción en el mismo compartimento Transcripción y traducción acopladas Genes organizados en operones No existen intrones en procariontes

Técnicas de Ingeniería Genética

Endonucleasas de restricción Son enzimas que rompen el enlace fosfodiéster del DNA (endonucleasas), producidas por bacterias Reconocen secuencias de nucleótidos específicas en el DNA, de tamaños que oscilan entre 4 y 8 pares de bases Forman parte de un sistema de modificación-restricción de las bacterias , utilizado para defenderse de la invasión de DNA exógeno (restos de DNA, virus, etc)

Endonucleasas de restricción permiten fragmentar el DNA Secuencias de reconocimiento son palíndromes Generan extremos cohesivos o romos

Otras enzimas de restricción

ELECTROFORESIS DE DNA: TÉCNICA PARA LA SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA DE DIFERENTE TAMAÑO

Electroforesis en geles de agarosa para separar fragmentos de DNA de acuerdo a su tamaño Gel de agarosa Cámara de electroforesis (-) (+) Los fragmentos mas pequeños migran mas rápido en el gel, los mas grandes lo hacen mas lentamente.

Mapa de restricción Ordenamiento de los sitios de restricción en un fragmento de ADN

Los fragmentos de DNA producidos por corte con una misma enzima de restricción pueden ser ligados para formar moléculas de DNA recombinante !!

Clonamiento de un gen Para clonar un gen o un fragmento de DNA en general, se requiere introducirla en una molécula “vector”. Un vector en ingeniería genética, es una molécula que sirve para transportar a otra hasta el interior de una “célula huésped”.

¿Cuáles son los vectores mas comúnmente usados? Plasmidos (DNA extracromosomal existente naturalmente en bacterias y levaduras, que se replica autónomamente) Virus bacterianos (bacteriófagos), o virus animales.

Los plasmidios son DNA circulares extracromosomales que se replican en forma autónoma

Uso de vectores para el clonamiento de un fragmento de DNA cromosoma Uso de vectores para el clonamiento de un fragmento de DNA Fragmento de DNA en un vector de clonamiento Al dividirse las células, también se duplica el DNA clonado en el vector, lo que permite propagar y amplificar la cantidad de DNA clonado Célula huésped División celular

Transformación de bacterias con DNA plasmidial

Sin embargo el procedimiento de transformación no es 100 % eficiente, por lo tanto se requiere un método para seleccionar e identificar las bacterias realmente transformadas con el plasmidio 12 h a 37 ºC Crecimiento de colonias de bacterias resistentes al antibiótico, que por lo tanto tienen el plasmidio

Clonamiento de DNA en un plasmidio

Características de un vector de clonamiento Sitios de corte por enzimas de restricción Gen de resistencia a ampicilina Gen de resistencia a tetraciclina Origen de replicación

Usos de un DNA recombinante Generar copias de un gen o fragmento de DNA Construir bancos de genes Secuención Mutagénesis Terapia génica Producir la proteína producto de un gen clonado Estudiar la proteína Producción de proteínas recombinantes para biotecnología (hormonas, vacunas, enzimas de uso industrial, etc)

Bacteriófagos como vectores de clonamiento

CELULAS USADAS COMO HUESPEDES DE CLONAMIENTO 1.  Células procariontes:   ·      Ventajas: crecimiento rápido, cultivo barato, fisiología y genética bien conocida. ·      Ej: Escherichia coli, Bacillus subtilis 2.        Células eucariontes: ·      Ventajas: estas células realizan modificaciones post-traduccionales (ej. Fosforilaciones y glicosilaciones) que son importantes para la actividad de muchas proteínas de eucariontes. ·      Ej. Levaduras, hongos, células de mamíferos en cultivo, células de insecto en cultivo.

Formas de introducir DNA exógeno en células huesped Transformación por electroporación en bacterias y en células eucariontes Infección en el caso de vectores virales Biobalística en el caso de plantas Fusión de liposomas en eucariontes Microinyección directa al núcleo

El problema: ¿Cómo es posible identificar y aislar un gen determinado desde un genoma que contiene miles de genes? Gen X

Desnaturación de DNA

Hibridización de DNA: Dos moléculas de ácidos nucleicos de una hebra que tienen secuencias complementarias pueden hibridizar: formando un complejo de doble hebra estable.

¿ Qué características debe tener una sonda de Ácidos Nucleicos ? Una sonda debe tener complementariedad de bases con el DNA blanco Puede ser de un organismo relacionado - una sonda heteróloga.

Otra forma de obtener una sonda: Traducción reversa de la secuencia de aminoácidos de una proteína

Hibridización de DNA Sonda de DNA marcada

Marcación radiactiva de DNA para generar “sondas” Desnaturación (90-100ºC) partidor + Rx de síntesis de DNA (DNA polimerasa dATP, dGTP, dTTP, dCTP (32P)* * * * + SONDA * * * * * *

“Southern blotting”

La técnica de Southern blot sirve para identificar genes Electroforesis de DNA genómico de diferentes cepas de Clamydomona Resultado de la hibridización del DNA con una sonda para un gen X Resultado: sólo algunas de estas cepas tienen el gen X

El problema: ¿Cómo es posible identificar y aislar un gen determinado desde un genoma que contiene miles de genes? Gen X

Clonamiento de un gen X desde un genoma Genoteca: conjunto de clones que contienen la totalidad de un genoma

Cada colonia es un conjunto de bacterias que tienen el mismo fragmento del genoma clonado Cada colonia representa un clon de bacterias genéticamente idénticas.

Identificación de un clon que contiene el gen de interés Sonda radiactiva Genoteca Reacción de hibridización autorradiografía

Creación de una genoteca de cDNA Genotecas de cDNA: Se usan para clonar genes de organismos eucariontes, para aislar sólo las partes codificantes de genes (exones). Creación de una genoteca de cDNA

Métodos de secuenciación Basados en la reacción de síntesis de DNA por una DNA polimerasa en presencia de un partidor. Objetivo: determinar la secuencia de nucleótidos en el DNA. En la síntesis se incorpora desoxinucleótidos (dNTP). Uso de un análogo de nucleótido didesoxinucleótidos (ddNTP). Análisis de los productos de la reacción mediante electroforesis en acrilamida

didesoxinucleótido Partidor marcado radiactivamente

ACGTGGAGCATGGTCATTAACGTAACGATCGATCGAGGCATGCG DNA clonado El DNA clonado, ¿es o no el gen que me interesa? Identificación de la secuencia del DNA clonado ACGTGGAGCATGGTCATTAACGTAACGATCGATCGAGGCATGCG Predicción de la secuencia de aminoácidos, de acuerdo al código genético Comparación con secuencias almacenadas en los bancos de datos ¿ Hay similitud con otras proteínas que tengan la función de la proteína de interés? Expresión para producir la proteína No Si

Reacción de Polimerización de cadenas (PCR)

Reacción de Polimerización de cadenas (PCR) Si el gen que que quiero aislar está en el DNA cromosomal Fragmento que se desea aislar

REQUERIMIENTOS PARA UNA REACCION DE PCR Una secuencia de DNA "blanco". Dos oligonucleótidos sintéticos, complementarios a los extremos del DNA blanco que se desea amplificar Una enzima DNA polimerasa termoestable Los cuatro desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). ´5' 3' 5'

Aplicaciones de la técnica de PCR Aislamiento de genes DNA para aplicaciones en clonamiento Diagnóstico de infecciones virales, bacterianas o parasitarias Diagnóstico de enfermedades genéticas, Identificación de individuos, Análisis forense, Monitoreo ambiental

APLICACIÓN DE PCR EN MEDICINA FORENSE

Un vector de expresión: usado para producir proteínas recombinantes Tu gen favorito operador

Por qué se requiere un sistema con promotor regulado? La sobreexpresión de una proteína impone un estrés metabólico a las células, bajando la velocidad de crecimiento. Algunas proteínas recombinantes pueden ser “tóxicas” para las bacterias. Por lo tanto, se requiere separar la fase de crecimiento de las células huéspedes de la fase de expresión del gen heterólogo.

El sistema de control del operón LAC (Promotor/Operador) es uno de los mas usados para la expresión regulada de PR PLAC OLAC Tu gen favorito Terminador Prot recombinante tiempo N de céls/ml IPTG IPTG = Isopropil -D galactósido Análogo de la lactosa