LA MELAMINA

INDICE: Introducción ¿Qué es la melamina? ¿Para qué se adulteró? Método oficial para la determinación de nitrógeno proteico en alimentos Métodos propuestos para detectar este tipo de fraudes Curiosidades del caso

INTRODUCCIÓN: El escándalo de la leche adulterada con melamina mató a 6 niños y afectó a otras 300.000 personas. Los bebés enfermos o incluso fallecidos fue por problemas renales. El Grupo Sanlu, mayor fabricante de leche en polvo y empresa responsable, fue condenado a pagar 6 millones de € de multa. 2 personas condenadas a muerte, 4 condenadas a cadena perpetua y otros 39 sospechosos. La leche adulterada llegó a traspasar fronteras: Myanmar, Bangladesh, Gabón, Burundi y Yemen.

¿PARA QUÉ SE ADULTERÓ? CHINA Y SU PROYECTO AMBICIOSO: Pretendía en 2008 tener el mayor incremento mundial en la producción de leche. Para ello en 2007 diluyeron la leche con agua añadiendo melamina para no disminuir el contenido proteico  Falsear controles de calidad.

LA MELAMINA: Fórmula química: C3H6N6 2,4,6-triamino-1,3,5-triazina MELAMINA ≠ MELANINA (pigmento de la piel) Poco soluble en agua. Sólido blanco. APLICACIONES: Adhesivos para hacer madera aglomerada, Espumas con base de resina de melamina, Abonos Manufactura de papel

LA MELAMINA: EFECTOS SOBRE LA SALUD: Por sus propiedades Fisico-Químicas favorecen su precipitación en vías urinarias  Acumulación de melamina en el riñón  Insuficiencia renal (piedras en el riñón) Problemas gástricos, asma y fibrosis pulmonar e incluso llegar a desarrollar cáncer y tumores.

MÉTODO OFICIAL PARA LA DETERMINACION DE NITRÓGENO PROTEÍCO EN ALIMENTOS Método Kjeldahl: consta de tres etapas. - Digestión de la muestra. - Destilación. - Volumetría ácido-base.

MÉTODO KJELDAHL 1. Digestión de la muestra: 2. Destilación: Proteína(s) + H2SO4 (ac) + Catalizador(s) → CO2 (g) + H2O (g) + NH4SO4 (ac) 2. Destilación: NH4HSO4 (ac) + 2 NaOH → NH3 (g) + Na2SO4 (ac) + H2O(g) NH3 (g) + H2O (g) → NH4OH (ac) 3. Valoración ácido-base.

Análisis del nitrógeno proteico según el BOE Preparación de la muestra: - Atemperar la muestra a 20ºC +/- 2ºC - Obtención de una dispersión homogénea de la materia grasa. Determinación: -Introducción en el matraz Kjeldahl de: * Perlas de vidrio * Sulfato de potasio * Óxido de mercurio II rojo * 5 g de leche exactamente pesados * 20 ml de Ác. Sulfúrico 96% -Calentamiento de la muestra hasta obtener un contenido líquido y sin espuma. -Calentamiento más intenso y ebullición (1:30h) hasta obtención de líquido limpio e incoloro.

- Enfriamiento y adición de agua - Adición de ácido bórico e indicador en un erlenmeyer a la salida del refrigerante. - Adición de NaOH que contenga sulfuro al matraz Kjeldahl - Calentamiento hasta ebullición - Destilación durante 20 min hasta ebullición a saltos - Enfriamiento del destilado y valoración con HCl 0,1M

- Realización de un ensayo en blanco. Muestra de 5gde agua. Cálculo del contenido total de nitrógeno: Nitrógeno total %= [ 1,40N (V1-V0)] / P N= normalidad del ácido clorhídrico V1= volumen en ml de ácido clorhídrico V0= volumen en ml de ácido clorhídrico utilizado en el ensayo en blanco P= peso en gramos de la leche empleada en el análisis La diferencia máxima entre dos determinaciones no debe sobrepasar el 0,005% de nitrógeno.

TOXICIDAD DE LA MELAMINA Dosis letal = 6g/kg de peso corporal. FDA determina un nivel de hasta 2,5 ppm de melamina para adultos y un límite de 1ppm para fórmulas infantiles. Técnicas sensibles y rápidas.

ESI-MS Electronebulizador por ultrasonido. Calibración previa con diferentes diluciones de melamina en leche. Se nebuliza directamente 3mL de muestra líquida sin tratamiento previo  Detección por MS. Límite de detección (muestra líquida) 500ppb Límite de detección (muestra sólida) 270ppb La sensibilidad se puede mejorar diluyendo la leche con agua pura.

ESPECTRO ESI-MS Pico de melamina 127 m/z

ESI-MS Ventajas: Consume pequeña cantidad de muestra. Análisis directo sin tratamiento de muestra. Alta especificidad. Excelente tolerancia con matrices complejas. Rápida detección.

Electroforesis capilar de zona Fundamento: Se utiliza la fuerte polaridad de la melamina para lograr su separación. Se emplea su excelente absorción en UV para determinar los niveles de residuos. Detector utilizado: UV con diodo en serie.

TRATAMIENTO DE LA MUESTRA La muestra se extrae con ultrasonido durante 10 min. Centrifuga a 4000 rpm durante 2 min El sobrenadante se filtra (filtro de 0.45 micras). Tiempo:15min

Condiciones de extracción La melamina se extrae con TCA (acido tricloroacetico) al 1%. Se eligió para precipitar las proteínas y disociar la melamina que es el objeto del análisis. Se añade 1 mL de cloroformo para que después de la centrifugación sea mas fácil de decantar. Después se utiliza una disolución tampón de NaH2PO4 a pH=3.2, para facilitar la extracción a la melamina como catión , protonando sus grupos amino. Al bajar el PH aumenta la resolución y la sensibilidad, pero a PH menores aumenta el ruido.

Resultados

Ventajas e inconvenientes Alta sensibilidad (0.01 ppm) Distribución lineal de los datos r=0.9995 Buena precisión. Recuperación de la muestra. Desventajas: Tratamiento de la muestra.

DAPCI-MS Desorption Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry: Sirve para analizar directamente muestras, sin necesidad de tratamiento previo y sin contaminación química.

DAPCI-MS

DAPCI-MS Análisis de leche en polvo: Como primer paso, se obtiene la fragmentación característica de la melamina protonada.

DAPCI-MS

DAPCI-MS

DAPCI-MS Análisis de leche en polvo: Una vez conocido el espectro, podemos comprobar si una muestra está contaminada con melamina.

DAPCI-MS

DAPCI-MS Análisis de leche líquida: Es recomendable detectar el ácido cianúrico presente, ya que forma con la melamina un complejo que puede ser más tóxico que dicha sustancia.

DAPCI-MS

DAPCI-MS

DAPCI-MS Límites de detección: Leche en polvo: 0’1 - 10.000 ppm Leche líquida: 6’6 - 0’01 ppb Tiempo de análisis: rapidez determinada por la concentración de melamina y procesado de la muestra. Entre 30s y 5min.

DETECCIÓN MEDIANTE EL USO DE ESPECTROSCOPÍA EN NIR Y FTIR IR-Medio: (Resolución 4 cm-1 , Rango espectral: 4000-650 cm-1) Se usan dos técnicas de muestreo para recolectar espectros: DRIFT (espectroscopía de reflectancia difusa) y ATR (espectroscopía de reflectancia total atenuada) Para el FTIR-DRIFT las muestras se mezclan con KBr (1:1), mientras que para el espectro en FTIR-ATR no es necesaria la adición de la sal. IR-Cercano: (Resolución:2 cm-1, Rango espectral:12500-3500 cm-1) Se llenan viales de 15 mm de diámetro con 5g de muestra. No es necesario un tratamiento previo.

FTIR-ATR y FTIR-DRIFT para la melamina pura y para la lEche en polvo

Espectros de absorbancia del NIR para la melamina y la fórmula infantil

Espectros de absorbancia del NIR para la fórmula infantil adulterada

Comparación NIR FTIR Los tres métodos son capaces de diferenciar si existe o no melamina sin equivocaciones en un corto periodo de tiempo. NIR necesita poco tiempo para el análisis, ya que el polvo se sitúa directamente en los viales y el espectro es analizado en menos de 2 min. FTIR necesita un tiempo algo mayor para el análisis (mostrado en la tabla 3). ATR sitúa la muestra directamente en el cristal ATR, y el DRIFT debe mezclarse inicialmente con KBr, prolongándose el tiempo de análisis a 5 min.

ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM (LTP-MS/MS) Fundamento → se induce la fragmentación de los iones formados a través de la colisión de éstos con átomos de un gas con el fin de obtener información estructural. La utilización de una nueva variante en la fuente de ionización → plasma de baja temperatura permite determinar trazas de melamina en los complejos sin necesidad de tratamiento previo de la muestra

VENTAJAS Análisis rápido y directo Elevada sensibilidad Elevado rendimiento Elevada especificidad Elevada precisión cuantitativa

MÉTODOS DE DETECCIÓN DE MELAMINA EN ALIMENTOS

COMPARACIÓN DE TÉCNICAS Tiempo de análisis Límite de detección Estado de la muestra Tratamiento de muestra Disponibilidad instrumento CZE-DAD 20 min 0,01 ppm Líquido Sólido Sí Media ESI-MS 120 muestras/h 500 ppb (l) 270 ppb (s) No DAPCI-MS 30s-5min 6’6-0’01 ppb(l) 0’1-104ppm(s) FTIR NIR 5min 2-3min 1ppm Alta LTP-MS/MS 25s-3min 6ppb Baja

BIBLIOGRAFÍA (1) Chan EYY, Griffiths SM, Chan CW. Public-health risks of melamine in milk products. Lancet 2008;372(9648):1444-1445. (2) Huang G, Ouyang Z, Cooks RG. High-throughput trace melamine analysis in complex mixtures. Chem Commun (Camb); Chemical communications (Cambridge, England) 2009(5):556-558. (3) Mauer LJ, Chernyshova AA, Hiatt A, Deering A, Davis R. Melamine Detection in Infant Formula Powder Using Near- and Mid-Infrared Spectroscopy. J.Agric.Food Chem. 2009;57(10):3974-3980. (4) Yan N, Zhou L, Zhu Z, Chen X. Determination of melamine in dairy products, fish feed, and fish by capillary zone electrophoresis with diode array detection. J.Agric.Food Chem. 2009;57(3):807-811. (5) Yang S, Ding J, Zheng J, Hu B, Li J, Chen H, et al. Detection of Melamine in Milk Products by Surface Desorption Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry. Anal.Chem.(Washington, DC, U.S.); Analytical Chemistry (Washington, DC, United States) 2009;81(7):2426-2436. (6) Zhu L, Gamez G, Chen H, Chingin K, Zenobi R. Rapid detection of melamine in untreated milk and wheat gluten by ultrasound-assisted extractive electrospray ionization mass spectrometry (EESI-MS). Chem Commun (Camb); Chemical communications (Cambridge, England) 2009(5):559-561.