CROMATOGRAFÍA DE GASES CON DETECTOR DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS: GC-MS 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

software Muestreador automático Cromatograma 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Funcionamiento del GC: la columna cromatográfica 5% diphenyl dimethylpolysiloxane La elevada resolución en GC capilar, evita el tener que usar muchas columnas de diferentes selectividades. 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Ionización “dura”, produce gran fragmentación Funcionamiento del MS: la fuente de ionización por Impacto Electrónico (EI) Ionización “dura”, produce gran fragmentación 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

(en el SIC la librería es la NIST-08) Funcionamiento del MS: la fuente de ionización por Impacto Electrónico (EI) La EI es muy reproducible, incluso entre equipos de distintos fabricantes Posibilidad de LIBRERÍA DE ESPECTROS DE MASAS . “HUELLAS DACTILARES DE LAS MOLECULAS” El software de los equipos GCMS permite comparar los espectros de masas con los que proporciona la librería suministrada para identificar compuestos desconocidos (en el SIC la librería es la NIST-08) 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Funcionamiento del MS: la fuente de ionización por Ionización Química Positiva (CI) MeOH Ionización blanda, proporciona información del PESO MOLECULAR DEL COMPUESTO 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Funcionamiento del MS: el analizador de masas (Trampa de Iones) Separa los iones por sus masas y después los cuenta Full Scan, SIM o Ms/Ms 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Funcionamiento del MS: el analizador de masas (Trampa de Iones) De espectro de masas a cromatograma 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Funcionamiento del MS: el analizador de masas (Trampa de Iones) Análisis TIC Full Scan: el cromatograma (señal vs tiempo) es de todos los iones. Análisis SIM: el cromatograma (señal vs tiempo) es de uno o unos pocos iones. Análisis Ms/Ms: el cromatograma (señal vs tiempo) es de los iones “hijo” procedentes de la fragmentación de un ion “padre” previamente seleccionado. Dr. Rafael Núñez Gómez. 20-02-2015

Funcionamiento del MS: El Software. La librería NIST 08 -15 -14 NIST 08: 220.460 espectros NIST 14: 276.248 espectros 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Según las características de la investigación CUANDO USAR GC-MS Según las características de la investigación Compuestos desconocidos (identificación o información estructural) Compuestos conocidos (screening o cuantitativo) 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Compuestos desconocidos: metabolitos de pesticidas. Tebuconazol Muestra inicial Oxifluorfen Inicial Oxyfluorfen Muestra a los 30 días Disminución clara de Oxyfluorfen pero no de Tebuconazol A los 30 días 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Compuestos desconocidos: metabolitos de pesticidas. RH-35451 RH-120162 RH-35450 Metabolitos de Oxifluorfen tras estudiar los espectros de fragmentación. No se tienen los patrones puros ni aparecen en la librería. Tebuconazol Muestra inicial Oxyfluorfen Muestra a los 30 días Disminución clara de Oxyfluorfen pero no de Tebuconazol 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

2. Compuestos desconocidos: Presencia de Salicilato de Hexilo en plantas de olivo infectadas con E. Olivina Planta no infectada Planta infectada Salicilato de metilo Salicilato de hexilo Planta no infectada Planta infectada Dr. Rafael Núñez Gómez. 20-02-2015

3. Compuestos conocidos: análisis de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PHAs) por SIM naftaleno C1-naftalenos C2- naftalenos C3- naftalenos fenantreno BTEX 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

4. Compuestos conocidos: Análisis de pesticidas por Ms/Ms Patrón con 90 pesticidas (método desarrollado para 130) El MS separa lo que no separa el GC: máximo poder de confirmación. 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

4. Compuestos conocidos: Análisis de pesticidas por Ms/Ms. Cuantitativo con patrón interno (P.I.) Muestra con 90 pesticidas (método desarrollado para 130) Clorpirifos r2 0,997719 RSD 7,179% Etofenprox r2 0,997033 RSD 7,751% Tetraconazol r2 0,998165 RSD 9,252% Entre 10 y 100 ppb (ng/ml) 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

CUANDO USAR GC-MS Según las características de la investigación Compuestos desconocidos (identificación o información estructural) Compuestos conocidos (screening o cuantitativo) Según las características de la matriz Gases permanentes (nuevo equipo microGC) Compuestos volátiles (HS, SPME, nuevo ITEX-2) Soluciones acuosas (SPME con o sin derivatización) Soluciones orgánicas (inyección líquida) Otras matrices requieren de extracción previa 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Nuevo equipamiento: análisis de gases permanentes mediante MicroGC 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Nuevo equipamiento: análisis de gases permanentes mediante MicroGC 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Análisis de compuestos volátiles: el automuestreador con Head Space 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Análisis de compuestos volátiles: el automuestreador con SPME Extracción-Cocentración-Análisis, todo automatizado y en línea con el GC Muy sensible (ppt) Análisis de volátiles Análisis de sólidos (Head Space) Análisis de soluciones acuosas (Head Space o Inmersión) 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Análisis de volátiles en Plantas con SPME. 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Análisis de volátiles en Plantas con SPME. 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Ejemplo de análisis de volátiles en Plantas. Identificación de volátiles en plantas de tomate Muestra problema Posible compuesto CAS number Formula Inyecc. Planta L8 (1) 1-28-2013 3-04-47 Tiempo Retencion Indice de Retencion Indice de Retencion Teorico (NIST) 13,278 936,3 alfa pinene 7785-70-8 C10H16 948 15,212 969,1 1,3,5-Cycloheptatriene, 3,7,7-trimethyl 3479-89-8 C10H14 1010 16,197 986,3 beta pinene 127-91-3 943 16,694 995,0 2-Carene 554-61-0 17,014 1000,7 γ-Terpinene 99-85-4 998 17,582 1010,9 α-Terpinen 99-86-5 18,298 1023,8 limonene 138-86-3 1018 19,202 1040,4 1,3,6-Octatriene, 3,7-dimethyl-, (Z,E) 13877-91-3 976 21,106 1076,3 α-Terpinolen 586-62-9 1052 32,859 1326,8 sesquiterpeno 1 C15H24 33,097 1332,4 δ-Elemene 20307-84-0 1377 35,4 1388,2 β-Elemene 515-13-9 1398 36,76 1422,2 β-Caryophyllene 87-44-5 1494 37,03 1429,0 γ-Elemene 339154-91-5 1465 37,59 1443,3 sesquiterpeno 2 38,194 1458,9 α-Caryophyllene 6753-98-6 1579 39,22 1485,8 Germacrene D 23986-74-5 1515 42,32 1570,1 sesquiterpeno 3 43,23 1595,8 Caryophyllene oxide 1139-30-6 C15H24O 1507 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Nuevo equipamiento: el Automuestreador con ITEX-2 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Análisis de soluciones acuosas con SPME: Degradación de dicloroanilina por hongos. DOS OPCIONES DE MUESTREO SOLUCIÓN ACUOSA Inmersión Directa para poco volátiles Espacio en Cabeza para volátiles 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Análisis de soluciones orgánicas: inyección de líquidos. Se inyecta 1-2µl normalmente 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Análisis de soluciones orgánicas: ácidos grasos con EI y CI. Derivatizados como ésteres metílicos (fames) Patrón Fame Mix Supelco 47885-U. Ionización EI. Ionización CI. Ácido C18:0 como ester metílico MW=158 Fragmentos típicos de los ácidos grasos (fames). El ión molecular m/z 158 apenas se observa ? No hay fragmentación, solo ión molecular M+1 = m/z 159 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Análisis de soluciones orgánicas: aminoácidos en extracto de aceite de oliva (derivatizados como TBDMS). Ala Gly Val Leu i-Leu Pro Met Ser Thre Phe Asp. Acid Cys Glu. Acid Arg Lys His Tyr Tryptophan P.I. Patrón de 500pmoles/µl (derivatizados TBDMS) Muestra real 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Análisis de azúcares en tomate Cherry (derivados TMSO). Glucosa 1 Glucosa 2 + Galactosa 2 Fructosa 1 Fructosa 2 Análisis de azúcares (derivados TMSO) en 67mg de Tomate Cherry Sacarosa Aprox. 8ppm Inositol 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Otras matrices requieren de extracción previa: Secado Liofilizado Homogeneizado Extracción por Líquido/Líquido, Ultrasonidos, Soxhlet, Columnas SPE, etc. Concentración Aclarado Adición de Patrón Interno Derivatización … Lo debe realizar el usuario con nuestra supervisión 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

CUANDO USAR GC-MS Según las características de la investigación Compuestos desconocidos (exclusivamente por GCMS) Compuestos conocidos (screening o cuantitativo) Según las características de la matriz Gases permanentes (nuevo equipo microGC) Compuestos volátiles (HS, SPME, nuevo ITEX-2) Soluciones acuosas (SPME con o sin derivatización) Soluciones orgánicas (inyección líquida) Otras matrices requieren de extracción previa Según las características de la molécula Peso molecular <500 u.m.a. Polaridad baja o media (derivatización) Fácilmente volatilizable (<300°C) No ionizada Siempre fragmenta Ácidos grasos Aminoácidos Monosacáridos y disacáridos Alcanos PHAs Aldehidos, cetonas y alcoholes simples Volátiles en plantas Pesticidas y metabolitos Ácidos fenólicos Gases permanentes 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Qué es la derivatización. Es un proceso que permite: El análisis de compuestos con poca volatilidad o estabilidad. Mejorar el comportamiento cromatográfico o la detectabilidad. Se realiza modificando químicamente los grupos funcionales (-OH, -COOH, -NH, -SH) para hacerlos más apolares e inertes. 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Qué es la derivatización. Sililación: R-OH  R-O-Si(CH3)3 ; derivados TMS (uso general). R-OH  R-O-Si(CH3)2C(CH3)3 ; derivados TBDMS (para aa). Acilación: R-OH  R-O-COCH3 Alquilación: R-COOH  R-COOCH3 ; derivados FAME (para ácidos grasos). 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

ANALISIS DE MUESTRAS MARCADAS CON ISOTOPOS ESTABLES 13C, 15N, 2H, 18O 257 243 Fame 13C14:0 MW 242+14=256 Fame C14:0 MW 242 243 252 257 Fame C15:0 MW 256 287 Fame 13C16:0 MW 270+16=286 271 Fame C16:0 MW 270 271 282 Fame 13C18:0 MW 298+18=316 317 299 Fame C18:0 MW 298 300 310 Muestra natural Muestra marcada 13C 30% Muestra marcada 13C 99% 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Gracias Y recuerda… 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.