Aislamiento de Acidos Nucleicos Liza Jiménez, PhD, JA Cardé, PhD Biol 4019 – Lab Biología Celular Molecular Universidad de Puerto Rico, Aguadilla

Objetivos Explicar diferentes métodos de aislamiento de ácidos nucleicos. Contrastar las ventajas y desventajas de los diferentes métodos de aislamiento de ácidos nucleicos. Describir las funciones de las diferentes soluciones utilizada en las técnicas de aislamiento de ácidos nucleicos. Realizar una extracción de DNA utilizando los métodos de lisis hipotónica, lisis enzimática y fenol - cloroformo. 

Introducción Los ácidos nucleicos y las proteínas se encuentran bajo estudio constantemente. Los investigadores necesitan familiarizarse con las técnicas utilizadas estudiarlas. Los problemas asociados con el estudio de estas son particulares y únicos para cada uno: DNA, RNA, proteínas Nos centraremos en el estudio de las técnicas de aislamiento de ácidos nucleicos. Las técnicas de aislamiento de proteínas serán discutidas posteriormente 

DNA Molécula muy resistente La mayor preocupación es la contaminación. El DNA aislado puede ser genómico o extracromosomal (figura 1). El DNA genómico es de gran tamaño El DNA extracromosomal es aislado de bacterias en forma de fagos o plásmidos. El método de aislamiento y almacenamiento del DNA extracromosomal es distinto al del DNA genómico. En este módulo estudiaremos las técnicas de aislamiento de DNA genómico.  como se espera de la macromolécula que transfiere la información genética de generación en generación de reactivos y de las muestras con DNA extraño.    El DNA genómico es de gran tamaño y debe ser manipulado con cautela para evitar romperlo.

DNA Genómico vs Extracromosomal

Lísis El rompimiento o lísis celular es el primer paso para obtener el DNA genómico. Varias técnicas son utilizados para provocar lísis celular. Entre ellas se encuentran: lisis hipotónica   lisis enzimática.  

Métodos: Lisis Hipotónica Se utiliza una solución hipotónica que causa la hinchazón de la célula y el rompimiento de la membrana plasmática y/o de la pared celular. Junto a las sales se pueden añadir detergentes, que ayudan a degradar los  lípidos de la membrana. (Detergentes no iónicos, i.e. Tween 20 y Triton X-100, utilizados con células de mamíferos y detergentes iónicos i.e. SDS para células con pared celular o cutícula externa que la protege)    En algunos casos es necesario utilizar un poco de fuerza mecánica (homogenizadores y nitrógeno líquido). A veces bacterias, esporas y levaduras se agitan junto a glass beads. En otras ocasiones se utiliza nitrógeno líquido. Este equilibra la célula y cuando la presión se libera, el nitrógeno sale de la solución formando unas burbujas que rompen la membrana celular. El frío generado por el nitrógeno protege las proteínas de ser degradadas.  

Métodos: Lisis Enzimática   Parecida a la lisis hipotónica. Se utilizan las mismas soluciones y detergentes anteriormente mencionados además de enzimas que catalizan la reacción. La función principal de la enzima es la degradación de los peptidoglicanos presentes en la pared celular (i.e. bacterias Gram positivas). Entre las enzimas utilizadas en esta técnica se encuentran lisozima y proteinasa K.      Posterior a la lisis hipotónica y la lisis enzimática se realiza una extracción fenólica. Utilizada para remover proteínas que se encuentran contaminando el DNA. El fenol y/o cloroformo no se mezclan con el agua formando fases separadas cuando se tratan de mezclar. Cuando la solución acuosa de DNA se mezcla con fenol y/o cloroformo las proteínas se mueven a la fase orgánica, formada por el fenol y/o cloroformo, dejando así el DNA en la fase acuosa (figura 2). La fase acuosa con el DNA se remueve y el DNA es precipitado utilizando etanol y sales.

Extracción Fenólica

RNA Su aislamiento es considerado más difícil que el de DNA y es necesario utilizar una mayor precaución. Por esta razón se sugiere el uso de reactivos y amortiguadores preparados por compañías especializadas para la preparación de los mismos. Algunos de estos reactivos y amortiguadores son específicos para el aislamiento de mRNA que comprende, generalmente, entre un 5-10 % del RNA total en una célula.

Materiales 4 M Acetato de amonio (Sodio) Agitadores de vidrio Centrífuga clínica Cloroformo Cultivo de Bacterias DEB Etanol al 95 % Fenol MIcrocentrifuga Micropipetas Microtubos de 1.5 ml Mosquitos Pipetas desechables Plato agitador Propipetas Puntas para micropipetas Tubos de ensayo de 5 ml

DEB C1V1 = C2V2 SDS 50 mg 0.5 % Tris 1M pH 8.0 0.1ml 10mM EDTA 0.5M Reactivo Volumen Concentración Final SDS 50 mg 0.5 % Tris 1M pH 8.0 0.1ml 10mM EDTA 0.5M 0.5 ml 25 mM NACl 5M 0.4 ml 0.2M C1V1 = C2V2

Protocolo: Mosquito   1)  Coloque un mosquito en un tubo de 1.5 ml. Añada 500 µl del amortiguador DEB*.  2) Utilizando un agitador de vidrio previamente esterilizado homogenice el mosquito hasta que no observe pedazos grandes del mismo.   3) Añada 500 µl de fenol y mezcle utilizando el vortex.  4)  Centrifugue por 10 minutos a 12,000 rpm.   5) Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 ml (figura 2) y añada 250 µl de fenol y 250 µl de cloroformo. Mezcle utilizando el vortex.  6) Centrifugue por 5 minutos a 12,000 rpm.  7) Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 ml y añada 250 µl de cloroformo.  Mezcle utilizando el vortex.   8) Centrifugue por 5 minutos a 12,000 rpm.  9) Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 ml y añada 27 µl de 4M acetato de amonio y 473 µl de 95 % etanol.   10) Coloque el tubo de 1.5 ml  sobre el plato agitador y agite por 10 minutos. Guarde el tubo a – 20 ºC hasta el próximo laboratorio

Protocolo: Bacterias I - Hipotónica 1) Centrifugue por 10 minutos el tubo de ensayo que contiene en un medio líquido las bacterias. 2) Descarte el sobrenadante y retenga el precipitado de bacterias. Añada 1 ml del amortiguador DEB* y 1 ml de fenol. Mezcle utilizando el vortex hasta que no observe el precipitado de bacterias. 3) Centrifugue por 10 minutos a 4,000 rpm. 4) Transfiera el sobrenadante a un tubo de ensayo limpio (figura 2) y añada 500 µl de fenol y 500 µl de cloroformo. Mezcle utilizando el vortex. 5) Centrifugue por 5 minutos a 4,000 rpm. 2 750 + 750 4 500 + 500 6 500 27 + 473

Protocolo: Bacterias I cont 5) Centrifugue por 5 minutos a 4,000 rpm.  6) Transfiera el sobrenadante a un tubo de ensayo limpio y añada 500 µl de cloroformo. Mezcle utilizando el vortex.  7) Centrifugue por 5 minutos a 4,000 rpm.  8) Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 ml  y añada 27 µl de 4M acetato de amonio y 473 µl de 95 % etanol.  9) Coloque el tubo de 1.5 ml  sobre el plato agitador y agite por 10 minutos. Guarde el tubo a – 20 ºC hasta el próximo laboratorio.  2 750 + 750 4 500 + 500 6 500 27 + 473

Protocolo Bacteria II - Enzimática 1) Centrifugue a 4,500 g por 20 min. 2) Añada 1 ml de Buffer de Lysis con 15 µl de Proteinasa K (200 µg/ml). 3) Deje por 30 min a 56 ˚ C. 4) Deje por 10 min a 95 ˚ C 5) Añada 20 µl de RNasa (1.5 mg/ml) y déjelo a 37 ˚ C por 30 minutos. 6) Deje por 15 min a 70 ˚ C

Protocolo de Bacteria II … continuación 7) Añadir (Lavar) igual volumen de 95 % de etanol. Guardar a -20 por una semana. 8) Centrifugue a 12,000 rpm por 5 minutos 9) Lavar 3 X veces con 70 % etanol. (1 10) Después de cada lavada centrifuge a 12,000 rpm por 5 minutos. 11) Hidratar con 30-50 % de TE.

Preguntas ¿Por qué necesitamos utilizar un sistema de homogenización cuando aislamos DNA de mosquito?   Mencione y explique 3 métodos para prevenir la contaminación del DNA.  Cuando la solución acuosa de DNA se mezcla con fenol y/o cloroformo las proteínas se mueven a la fase formada por el fenol dejando así el DNA en la fase acuosa. Explique este fenómeno haciendo referencia a la estructura y enlaces de las macromoléculas.  Mencione y explique 3 técnicas utilizadas para el aislamiento de DNA que no se hayan discutido en clase. Explique la función de los 4 reactivos del DEB.

Virtual Labs DNA Extraction Plant DNA Extraction