Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern

Presentación del tema: "Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern"— Transcripción de la presentación:

1 Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern
Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa) Extracción del ADN Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern

2 Relevancia del Aislamiento del ADN
La extracción de ADN es el primer paso en la tecnología del ADN. • Determinación del perfil de ADN • Clonación • Diagnóstico de enfermedades • Determinación de secuencias de ADN • Transferencia génica: Organismos Modificados Genéticamente (OMG), agricultura, farmacéutica Pruebas ambientales, bioterrorismo DNA extraction is one of the first steps to many research, forensic or clinical analyses. Extracting one's own DNA and making it visible by precipitation is a visible and tangible way to explore DNA.

3 ¿Cuáles son las estructuras de una célula?
This experiment fits well into exploring cell structures: Where is the DNA located? What properties of cell membranes allow us to break them open with detergents? Why is protease used to assist in extraction of DNA? Further discussion later in workshop.

4 Tipos de Células Examples of cell types

5 Tipos de Células Lysozome

6 Tipos de Células Chloroplasts in a plant cell. The dark, oval shapes are starch granules within the chloroplasts.

7 Resumen del Protocolo: Extracción de ADN Genómico
• Utilización de agua como enjuague para la recogida de las células bucales • Añadir el búfer de lisis para romper las membranas nucleares y celulares y liberar el contenido nuclear • Utilización de la proteasa para digerir las proteínas celulares • Precipitación del ADN con alcohol frío y alta concentración de sal. Overview of main steps in experiment.

8 Extracción de ADN : Paso-a-Paso
Graphic overview chart

9 Puesto común (Puesto del Maestro)
Baño a 500C Botella de isopropanol 91% o etanol 95%, en hielo Puesto de trabajo de los alumnos Número (4 Estudiantes/Puesto de trabajo ) Tubos de15 ml con 3 ml de agua 4 Microtubo rosa marcado “prot”, con 1.25 ml de proteasa rehidratada con sal 1 Tubo de 15 ml tubo marcado “lisis” con 10 ml de búfer de 1 Pipetas de plástico 6 Gradilla de hule espuma para los tubos 1 Marcador de tinta indeleble 1 Taza de papel dispensable o un beaker para sostener los tubos de 15 ml y la subsiguiente colección de basura Materiales para hacer el collar de ADN o un micortubo de1.5ml 1 Guía rápida 1 Extracción y Precipitación de ADN Listado de Materiales 4 Estudiantes/Puesto de trabajo para un total de 36 Estudiantes For efficient time management, begin the extraction protocol and discuss experiment during incubation times. The student workstations have the indicated items for a group of 4 students per workstation. The protease must be rehydrated before use; once rehydrated, the protease will remain active for several weeks if stored at 4oC.

10 Es de vital importancia realizar una abundante recogida de células.
Para mejores resultados, asegúrese que los alumnos empleen la suficiente cantidad de tiempo recogiendo las células de la mucosa bucal. Pueda que la colección de muestra en el tubo de 15 mL sea difícil. Puede utilizar un vaso pequeño para dispensar y coleccionar la muestra. This step cannot be stressed enough. Best results happen when class collects cells as a group, with one person keeping time. The instructor can "cheerlead" to encourage ample cells are collected. For teachers that have done DNA extraction from strawberry or thymus, fewer cells collected in this experiment. It is imperative that sufficient cells are collected.

11 Protocolo de Práctica de Laboratorio
Obtenga del instructor un tubo de 15 mL que contenga 3 ml de agua. Marque el tubo con sus iniciales. 2. Cuidadosamente mordisquee el interior de los cachetes por 30 segundos. ¡No sirve de nada sacar sangre! 3. Tome el agua del tubo de15 mL, y con el agua enjuague por 30 segundos. 4. Cuidadosamente escupa el liquido de regreso al tubo de 15 mL. Pasos 1 − 4 After everyone labels a 15 ml tube containing water with their initials (use permanent marker and label the tube on its side), begin collecting as a group. The hardest part of this exercise will be to expel the mouth wash back into the 15ml tube. You may wish to collect the mouth wash into a cup and then pour the mouth wash into a 15 ml tube instead.

12 Protocolo de Práctica de Laboratorio
5. Obtenga el tubo de búfer de lisis del puesto de trabajo y añade 2 mL de búfer de lisis a su tubo que contiene el extracto celular. 6. Cierre el tubo e inviértalo suavemente para mezclar los componentes. (¡No lo mezcle muy duro!). Observe su tubo — ¿Ve algunos cambios? Anótelos. Pasos 5 − 6 If anyone ends up with a lot more than 5 mls (7 mls or more), they need to remove the excess and discard it. DNA precipitation may not occur optimally if much more than 5 mls of cell lysates are present when alcohol is added during the precipitation step. It’s important NOT to shake the lysed cells – this will shear the DNA (break it into small fragments) and shorn DNA will not precipitate well.

13 Protocolo de Práctica de Laboratorio
7. Obtenga el tubo de proteasa (marcado “prot”) de su puesto de trabajo. Añade 5 gotas de proteasa a su tubo. 8. Cierre el tubo y voltéelo suavemente varias veces. 9. Coloque su tubo en la gradilla o en un beaker en el baño de agua y déjelo incubar por 10 minutos a 50°C. Pasos 7 − 9 It’s important NOT to let students shake the tubes – the DNA will shear, and DNA will not precipitate well if it’s shorn.

14 Extracción y precipitación de ADN
¿Por qué se lleva a cabo cada paso?

15 Colección de células El mordisqueo del interior de la boca, en combinación con el enjuague de agua funciona para separar las células del epitelio alineando la boca. Es crítico recoger la cantidad suficiente de células. Epithelial cells are constantly being sloughed off an provide an easily accessible cell supply. Note: eating food, chewing gum, or dental work just prior to the exercise may affect ample cell collection. To achieve maximum success (largest DNA precipitates), it’s recommended that people don’t engage in these activities just prior to performing this exercise.

16 2. Búfer de Lisis ¿Qué es el Búfer de Lisis. • 50 mM Tris-HCI, pH 8
2. Búfer de Lisis ¿Qué es el Búfer de Lisis? • 50 mM Tris-HCI, pH 8.0 • 1% SDS Búfer deTris para mantener el pH de la solución en el cual ADN se mantiene estable 1% SDS para romper y abrir las membranas celulares y nucleares permitiendo que el ADN quede libre en la solución. El detergente SDS desnaturaliza y desdobla las proteínas dejándolas accesibles para las proteasas. O S - CH2 CH3 SDS Can talk about lipid bilayer model of cell membranes and how detergents work. Na+

17 3. ¿Por qué utilizamos la proteasa?
• La proteasa se utiliza para destruir las proteínas nucleares que crean un enlace con el ADN y para destruir enzimas citoplasmáticas que degradan y destruyen el ADN. • El tratamiento con proteasa incrementa la cantidad de ADN intacto que es extraído. Histones, which cause DNA to supercoil (compact) in the chromosome, are proteins.

18 4. Adición de la solución salina
• La solución de proteasa ya contiene sal. • Los iones de Na+ del NaCI forman enlaces con los grupos de fosfato de las moléculas de ADN, neutralizando las cargas eléctricas del ADN. • La adición de NaCI permite que las moléculas de ADN se junten en lugar de repelerse una a la otra. De esta manera se facilita la precipitación del ADN de la solución al añadir el alcohol.

19 Sólo se muestra una cadena de ADN.
La Estructura del ADN Na+ O CH2 P Base OH Azúcar Sólo se muestra una cadena de ADN. Graphic showing Na+ ions associating with negatively charged phosphate groups on DNA backbone.

20 5. Precipitación del ADN con alcohol frío
• El ADN no se disuelve en alcohol. • El añadir alcohol hace que el ADN se agregue y se precipite de la solución. Las moléculas del ADN precipitadas parecen un material fibroso, como los hilos blancos de una telaraña. Las burbujas microscópicas de oxígeno, que se generan al mezclar, se “agregan” al precipitarse el ADN. Las burbujas visibles más grandes, levantan el ADN fuera de la solución y lo llevan de la fase acuosa a la fase orgánica (fase del alcohol).

21 Protocolo de Práctica de Laboratorio
Pasos 10 − 12 10. Lentamente añade 10 ml de alcohol frió manteniendo el tubo a un ángulo de 45°. Este paso va a requerir de varias adiciones utilizando la pipeta de transferencia desechable. 11. Deje el tubo en posición vertical en la gradilla, a temperatura ambiente y en reposo, durante 5 minutos ¿Que ve? 12. Cierre el tubo y voltéelo de lado y de regreso en posición vertical, con mucho cuidado, unas 10 veces, hasta que las fases de agua y alcohol queden mezcladas y el ADN salga de solución. It is important to add the alcohol gently and keep tube at a 45 degree angle. After a few minutes, they should see small bubbles with DNA strands attached. If they see a nice clump of DNA, they can remove it to necklace vial before inversion. Alternatively, they can gently mix/tilt their test tube to see the DNA come out of solution and then make a necklace. It's important NOT to shake and dissociate the DNA that is precipitating.

22 Preparación de los tapones para los collares
1. Remueva el tapón de plástico del frasco de vidrio. 2. Recorte las “orejas” de dos lados del tapón de plástico. 3. Regréselo al frasco para crear los collares más tarde. ¿Porque? Para que el tapón no cree una bolsa de aire que prevenga que el frasco quede correctamente cerrado

23 Preservando la muestra de ADN: Preparación del collar de ADN
Utilizando una pipeta desechable, transfiera las fibras de ADN que ha extraído al pequeño frasco de vidrio. – Transfiera la mayor cantidad de ADN con la menor cantidad de alcohol posible. – El frasco se debe rellenar dejando por lo menos 2 mm de espacio suficiente para el tapón de plástico. First, remove the plastic stopper from the vial (you will replace the stopper after transferring your DNA). Don’t lose the stopper! It’s small and hard to see. Next, using a disposable transfer pipet, carefully transfer the DNA strands to the glass amulet. Don’t overfill the amulet; the stopper will be difficult to seal on the vial if there is too much liquid inside.

24 Preservando la muestra de ADN: Preparación del collar de ADN
2. Introduzca el tapón de plástico recortado en el cuello del frasco y presione con firmeza para cerrarlo 3. Deslice el cordón encerado a través del tapón de plata 4. Aplique una pequeña gota de pegamento en el interior del tapón de plata. Necklace preparation is a little "fiddly" and may be done the next day if class time is limited. Place student samples in refrigerator until next class period if time is limiting.

25 Preservando la muestra de ADN: Preparación del collar de ADN
Coloque el tapón de plata sobre la boca del frasquito y presione con firmeza durante 30 segundos. Deje que el pegamento se seque durante minutos y después compruebe que el frasquito está completamente sellado. Cuando el pegamento se haya secado, ate el cordón encerado. People have a tendency to keep pushing and then pulling on the cap to see if it has dried. I encourage folks to leave their necklaces alone for several minutes without continuously pushing down. It will dry…

26 Genes en un Frasco ¡Felicidades!
¡Has creado un collar con tu propio ADN!

27 ¿Cuánto tiempo dura el collar de ADN?
El ADN puede durar años en el frasquito de vidrio. Con el tiempo puede añadir más alcohol si la cantidad original se ha evaporado

28 Genes en un Frasco Componentes del kit
DNA Extraction Module ( EDU): (contains enough material for 36 students) Lysis buffer, 150 ml Powdered protease + salt, 1.5 g 15 ml tubes, 50 Clear, flip-top microtubes, 60 Multicolor, flip-top microtubes, 60 Disposable plastic transfer pipets, 60 Foam microtube holders, 10 Curriculum, including a teacher’s guide, a graphic quick guide, and separate student instructions for basic and advanced-level instruction DNA Necklace Module ( EDU): (contains enough material for 18 DNA necklaces; order 2 modules for a classroom of 36 students) Glass vials, 18 Silver caps, 18 Plastic plugs, 18 Waxed string, 18 Super glue gel, 1 tube Instruction manual ( EDU) Materiales para 36 Estudiantes Above Kit Contains: (1) DNA Extraction Module ( EDU) (2) DNA Necklace Modules ( EDU) Required Accessories Not Included in Kit: 91% isopropanol (available from drugstores) or 95% ethanol, 360 ml Container of ice, 1 Permanent marker, 1–8 Recommended (Optional) Accessories: Water bath with thermometer EDU