Escuela Politécnica del Ejército Departamento de Ciencias de la Vida Carrera de Ingeniería en Biotecnología “Identificación del Virus de Papiloma Humano mediante PCR-RFLP y posterior genotipificación en muestras de tejido cervical parafinado, con diagnóstico histopatológico de displasia severa o cáncer in situ, procedentes del Hospital de SOLCA Núcleo Quito” Previa a la obtención del título de: INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA Elaborado por: Diana Jaqueline Vaca Llerena

ÍNDICE Introducción Materiales y métodos Resultados y discusión Conclusiones Recomendaciones ÍNDICE

INTRODUCCIÓN

Cáncer de cuello uterino Una de las principales causas de muerte de mujeres a nivel mundial. Representados en 530.000 nuevos casos de pacientes afectadas por año En el Ecuador, el cáncer cérvico-uterino ocupa el primer lugar como causa de muerte oncológica en población femenina representados en 750 muertes en el año 2005 Situación del Ecuador???

Situación del cáncer cérvico uterino en América País Tasa de incidencia Tasa de mortalidad Argentina 14,2 7,6 Bahamas 22,1 9,3 Bolivia 58,1 22,2 Brasil 31,3 11,6 Canadá 8,2 2,8 Chile 29,2 10,6 Colombia 32,9 13,7 Costa Rica 25 12,1 Cuba 23,8 República Dominicana 38,4 15,8 Ecuador 44,2 18,6 El Salvador 40,6 País Tasa de incidencia Tasa de mortalidad Guatemala 39,6 16,8 Guyana 51,1 20,6 Haití 93,9 53,5 Honduras Jamaica 43,4 18,4 México 40,5 17,1 Paraguay 41,1 15,8 Perú 39,9 Puerto Rico 10,3 4,3 Estados Unidos 7,8 3,3 Uruguay 13,8 7,6 Venezuela 38,3 15,2 Adaptado de: PAHO: Neoplasia maligna del cuello uterino en las Américas, tasa de incidencia y mortalidad por país por cada 100.000 Habitantes en el año 2000. Fuente: (Merle, 2004).

Causa de cancer cervical VIRUS DE PAPILOMA HUMANO Virus de ADN Icosaédrica Familia Papillomaviridae Virus de papiloma humano Tomado de Grupo Infección y Cáncer, 2008 Alrededor de 200 genotipos - Bajo Riesgo: 6, 11, 40, 42, 53, 54 y 57 - Alto Riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52 y 56 Neoplasias de alto grado y cáncer

Estructura Virus de Papiloma Humano Región temprana (E) E1 y E2 Control replicación y transcripción E6 y E7 Obstaculizan el control de transcripción celular (p53) y ciclo celular (pRb) E8, E5 y E4 Control transcripción de genes tempranos Región tardía (L) L1 Proteína estructural de la cápside (conservada) L2 Selecciona el ADN viral y lo ubica dentro de la cápside Región de control (LCR) Secuencias que promueven o reprimen la expresión o replicación viral Organización del Genoma de VPH Fuente: López, et al., 2006.

Lesiones de cuello uterino y VPH NIC 1 NIC 2 NIC 3 ① ② ③ ④ ⑤ Infección por VPH Producción Viral Sin producción viral Alta producción E6 y E7 Integración del ADN viral Patogenia del Cáncer de Cuello uterino Fuente: Adaptado de Ojeda 2010.

Diagnóstico molecular de la enfermedad PCR Tejido parafinado Raspado cervical Tejido fresco

Parafinado de tejido Fijación Formol buferado Deshidratación Alcohol Aclaramiento Xilol Inclusión Parafina Efecto de la fijación del tejido con formalina en el ADN. Fuente: QIAGEN, 2011.

OBJETIVO GENERAL Determinar la presencia del Virus de Papiloma Humano mediante PCR-RFLP e identificar genotipos prevalentes en muestras de tejido cervical parafinado, con diagnóstico histopatológico de displasia severa o cáncer in situ, provenientes del Hospital de SOLCA Núcleo Quito.

HIPÓTESIS Las técnicas de biología molecular son sensibles y específicas para la identificación y genotipificación de VPH a partir de muestras de tejido cervical parafinado con diagnóstico histopatológico de displasia severa o cáncer in situ.

MATERIALES Y MÉTODOS

Instituciones Participantes Centro de Biomedicina Universidad Central del Ecuador Laboratorio de Patología Hospital Oncológico SOLCA Quito Instituciones Cooperantes Instituto de Biomedicina Universidad Católica de Guayaquil LABIOMEX Universidad de los Andes, Mérida -Venezuela

Selección de tejido parafinado ① Extracción de material genético ② Identificación de presencia viral ③ Genotipificación por RFLP ④ Validación de los resultados ④ Validación de los resultados ⑤

Selección de muestras

Selección de tejido parafinado ① Extracción de material genético ② Identificación de presencia viral ③ Genotipificación por RFLP ④ Validación de los resultados ④ Validación de los resultados ⑤

Extracción de material genético 2 Ensayos preliminares Se probaron 6 protocolos tomados de bibliografía para el diseño de la técnica de extracción. Estandarización de técnica de extracción Protocolo Ch Xilol Proteinasa K Chelex - 100 Protocolo DCh HCl 0,1% Protocolo Fe Fenol - Cloroformo Protocolo DF

Extracción de material genético 3 Desparafinado Un lavado con Xilol a 65°C por 30 min Lavado Tres lavados con etanol 100% Digestión Buffer de lisis pH 8,2, SDS y Proteinasa K , a 37°C toda la noche

Extracción de material genético 4 Purificación Chelex-100 a 100°C por 30 min, con agitación cada 10 min Precipitación 2Vl. etanol 100% y 1/10 de acetato de amonio 3M, a -20°C por 2 días. Lavado con etanol 70%. Resuspención Se resuspendió el pellet en 60 µL H2O-PCR.

Selección de tejido parafinado ① Extracción de material genético ② Identificación de presencia viral ③ Genotipificación por RFLP ④ Validación de los resultados ④ Validación de los resultados ⑤

Identificación de presencia viral 1) PCR convencional para amplificación de gen de β-globina (control de hibridación) Primer Fragmento amplificado PC04 267 pb GH20 2) PCR convencional para amplificación de gen L1 de VPH Primer Fragmento amplificado MY 11 450 pb MY 09 3) PCR anidada para amplificación de gen L1 de VPH Primer Fragmento amplificado GP5+ 150 pb GP6+ Todas las amplificaciones se verificaron en geles de Agarosa al 1,5% 4) PCR semi-anidada para amplificación de gen L1 de VPH Primer Fragmento amplificado GP5+ 400 pb MY09

Criterios para diagnóstico molecular de muestras Reacción en cadena de la polimerasa Diagnóstico Infección con VPH Acción a seguir β- globina Primera Reacción Semi-anidada Anidada + - Positiva Tipificación Fin Negativa No viable Resultado inverosímil

Selección de tejido parafinado ① Extracción de material genético ② Identificación de presencia viral ③ Genotipificación por RFLP ④ Validación de los resultados ④ Validación de los resultados ⑤

Genotipificación de VPH por RFLP Enzima Sitio de corte HpyCH4V DdeI RsaI 5’… TG^CA …3’ 3’… AC^GT …5’ Todas las digestiones se verificaron en geles de poliacrilamida al 6% 5’… C^TNAG …3’ 3’… GANT^C …5’ 5’… GT^AC …3’ 3’… CA^TG …5’ Componentes HpyCH4IV [ ]f DdeI RsaI Tiempo de digestión Buffer 0,9 µL 1 X 0,8 µL Digestión por 2 horas a 37°C Inactivación por 5 min a 65°C Enzima 0,1 µL 1 U 1U Muestra 4 µL - Agua 4,9 µL 3,2 µL Total 9,1 µL 8,1 µL

Selección de tejido parafinado ① Extracción de material genético ② Identificación de presencia viral ③ Genotipificación por RFLP ④ Validación de los resultados ④ Validación de los resultados ⑤

Validación de selección de material genético Confirmación histopatológica. Control negativo de arrastre de contaminación. Validación de extracción de material genético e identificación viral Control de arrastre negativo de contaminación. Valoración cuantitativa y cualitativa de ADN extraído. Análisis de reproducibilidad de la técnica de extracción y amplificación en función al tiempo de almacenamiento.

Validación de resultados de genotipificación Secuenciación Producto de amplificación Purificación Amplificación de fragmento Precipitación y desnaturalización de ADN. Analizador genético Abi Prism 310 de Applied Biosystem Linear Array® Roche Muestra tipificada por RFLP Tipificación a NETLAB Laboratorios Resultado tipificación por Linear Array ®

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tamaño muestral Tras el proceso de selección de muestras: Fórmula para la estimación de la proporción para muestreo aleatorio simple Año Cáncer cervical Displasia severa 2005 8 2006 2007 2008 2009 2010 2011 n : 98 muestras Tras el proceso de selección de muestras: Se incluyeron 112 muestras que cumplieron con los criterios de inclusión

Localización geográfica de los pacientes 25% 56% 55% 44% 75% 44% 45% Frecuencias de distribución geográfica de los pacientes incluidos en el estudio. Frecuencias de diagnóstico histopatológico de pacientes incluidos en el estudio con relación su ubicación regional

Ensayos preliminares de extracción de ADN Trabajo con muestras parafinadas advierte gran complicación Electroforesis en gel de agarosa al 1.0% teñido con bromuro de etidio, de extractos de ADN Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio, de amplificados del gen β-globina Degradación proceso de fijación de la muestra Xilol caliente Degradación en el proceso de desparafinización Proteinasa K Presencia de inhibidores en la extracción Purificación Fenol o chelex

Estandarización de extracción de material genético Protocolo Ch Xilol Proteinasa K Chelex - 100 Protocolo DCh HCl 0,1% Protocolo Fe Fenol - Cloroformo Protocolo DF

Estandarización de la técnica de extracción 1 Gráfico de puntos de desviaciones estándares de concentraciones de ADN obtenidas de los diferentes protocolos de extracción. Gráfico de puntos de desviaciones estándar de ratios de 280/260 y 260/230 con de los diferentes protocolos de extracción de ADN Tras un análisis de varianza (ANOVA) y prueba de Tukey realizadas al 95% de confianza, se confirmó que la aplicación de algún tratamiento no influye estadísticamente en la concentración de ADN obtenida.

Estandarización de la técnica de extracción 2 Protocolo Ch e e e e 250 200 150 100 75 50 Protocolo DCh Protocolo Fe e 250 200 150 100 75 50 Protocolo DF Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio de la amplificación de un fragmento de 267 pb del gen β-globina de las muestras de ADN extraídas para la estandarización Poca manipulación de muestras No exposición a solventes Disminución de costo de la prueba

Extracción de ADN Se extrajo ADN de las 112 muestras con el protocolo Ch Electroforesis en gel de agarosa al 1.0% teñido con bromuro de etidio, de muestras de ADN extraídas

Identificación molecular de VPH Baja calidad de ADN obtenido tras extracción Incremento de sensibilidad pero no tipificable por RFLP Amplificación de un fragmento de 267 pb del gen β-globina Amplificación mediante PCR convencional de un fragmento de 450 pb del gen L1 de VPH. Incremento de sensibilidad y tipificable por RFLP Amplificación mediante PCR anidada de un fragmento de 150 pb del gen L1 de VPH. Amplificación mediante PCR Semi-anidada de un fragmento de 400 pb del gen L1 de VPH.

Amplificación del control interno Criterio Frecuencia observada % Frecuencia esperada* β-globina negativa 43 38 29 26 β-globina positiva 69 62 83 74 Total 112 100 ① Fo amplificación β-globina ≠ Fe amplificación de β-globina. Año de fijación del tejido Amplificación control interno 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Total general β-globina negativa 3 6 5 10 43 β -globina positiva 13 11 69 16 112 Cambio de equipo de fijación utilizado en SOLCA en estos dos años ② 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Xi2 β-globina 0,41 1,15 0,25 11,27 Criterio Fo = Fe Fo ≠ Fe Fo ≠F e Criterio Frecuencia observada % Frecuencia esperada* β-globina negativa 23 29 21 26 β-globina positiva 57 71 59 74 Total 80 100 ③ Fo amplificación β-globina = Fe amplificación de β-globina. 1,2 y 3 Cálculos realizados al 95% de confianza y 1 grado de libertad. * Tomado de de Sanjosé, 2010.

Identificación molecular de VPH Robustez para la tipificación de VPH es del 77% 97% de muestras positivas Puede estar relacionado a la presencia de adenocarcinomas ADN genómico en mayor proporción que ADN viral????

Resultados validados por la prueba bioinformática de enzimas Genotipificación Resultados validados por la prueba bioinformática de enzimas VPH Frecuencia 6 69% 31 7% 33 5% 39 4% 16 11 2% 51 59 52 VPH 16 = 63% VPH 6 < 1% Digestión de dos muestras con enzimas Hpy y Rsa para validación de resultados bioinformáticos.

Reproducibilidad de la técnica De extracción Observación 1 Observación 2 Número de muestras Bt p (2 colas) Concentración 1 Concentración 2 14 0,3368 Prueba estadística de Wilcoxon Dado que p > 0.05 No hay diferencia estadística De amplificación por PCR Prueba estadística de Chi cuadrado Reacción β-globina Reacción semi-anidada Reacción anidada Xi2 de la reacción 1,77 0,75 0,39 Criterio Acepta

Límite de detección por PCR para el ensayo β-globina Dilución 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 Concentración de ADN (ng/µl) 721 360,5 180,3 90,1 45,1 22,5 11,3 5,6 2,8 Amplificación independiente de la concentración de ADN Electroforesis en gel de agarosa al 1,5% para ensayo de límite de detección de gen de β globina.

Pruebas para validación de tipificación Método tesis Método para validación Resultado Muestra positiva para VPH 11 Secuenciación Muestra positiva para VPH 6 Linear Array ® VPH-IS39, VPH-33, VPH-67 y VPH-18 dudoso RFLP requiere integridad de la cadena que va a ser identificada… Muestras parafinadas????

CONCLUSIONES

CONCLUSIONES Región amazónica prevalencia de cáncer cervical Extracción de ADN viable con protocolo Ch. Los métodos de desparafinado y desteñido más agresivo Se descartó problemas de contaminación entre muestras. Muestras viables obtenidas en un 62% Aumento de sensibilidad permite detección de ADN viral. Positivos para presencia de VPH en un 93% de muestras viables. Los resultados de genotipificación lograron ser validados Reproducibilidad de la técnica de extracción confirmada. Se confirmó hipótesis planteada para esta investigación.

RECOMENDACIONES

RECOMENDACIONES El proceso de fijación y parafinización debe demostrar robustez. Conocer el protocolo de fijación de muestras parafinadas. Usar de controles negativos en los pasos susceptibles de contaminación. No se recomienda trabajar con muestras que hayan sido teñidas durante el proceso de fijación. No usar RFLP cuando no se tiene la certeza de integridad de ADN. Se recomienda la confirmación clínica de los resultados de genotipificación obtenidos en esta investigación.

Gracias por su atención