15. Propiedades de las proteínas

Titulación ácido-base de una proteína Carga negativa neta pI Carga positiva neta

Grupos disociables de una proteína (Se indica el pKa de la cadena lateral en cada caso) Ácidos (aniónicos, - ) Asp 3.86 Cys 10.78 Glu 4.25 Tyr 10.07 Básicos (catiónicos, + ) Arg 12.48 His 6.00 Lys 10.53 Aniónicos: carga negativa neta por encima de su pKa Catiónicos: carga positiva neta por debajo de su pKa

Proteínas ácidas: punto isoeléctrico (pI) inferior a 7 Ricas en Asp y Glu; al pH celular presentan carga negativa neta. Proteínas básicas: punto isoeléctrico (pI) superior a 7 Ricas en Arg y Lys; al pH celular presentan carga positiva neta. En el medio biológico, son, por lo general, más abundantes las proteínas ácidas.

- + Electroforesis Muestra 1. Se realiza sobre un soporte sólido o semisólido, para mini- mizar efectos de difusión 2. Se somete el conjunto a un campo eléctrico constante, a un pH fijo; las proteínas migran conforme a su carga eléctrica - + 3. Terminada la carrera electro- forética, las proteínas se tiñen con un colorante adecuado (p.e., Azul de Coomassie)

Fundamento de la cromatografía Muestra: tres componentes mezclados Fundamento de la cromatografía Se dispone una mezcla sobre una fase estacionaria Fase estacionaria Se hace fluir una fase móvil sobre la estacionaria Dependiendo de la afinidad relativa por ambas fases, los componentes de la mezcla primitiva se separan Fase móvil

Tipos de cromatografía 1. Intercambio iónico - Separa según carga eléctrica - Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte insoluble - Fase móvil: gradiente de sal o de pH 2. Partición - Separa según solubilidad en solventes - Fase estacionaria: Un solvente sobre un soporte sólido - Fase móvil: El otro solvente fluyendo

3. Afinidad - Separa según la afinidad de la proteína por un ligando inmovilizado - Fase estacionaria: ligando unido a soporte insoluble - Fase móvil: (1) solución sin ligando (2) solución con ligando libre 4. Hidrofóbica - Separa según hidrofobicidad - Fase estacionaria: grupos hidrofóbicos unidos a un soporte insoluble - Fase móvil: gradiente inverso de sal 5. Exclusión molecular - Separa según tamaño molecular - Fase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzados - Fase móvil: solución tamponada

- - - Intercambio iónico - + + + Proteínas adsorbidas al intercambiador iónico A baja concentración de sal, se desprenden las proteínas menos electronegativas A mayor concentración de sal se desprenden las proteínas más electronegativas

Soportes cromatográficos

Cromatografía de intercambio iónico

Cromatografía de adsorción a colorantes

Cromatografía de afinidad

Solubilidad pI pH Punto isoeléctrico

Solubilidad Salting out Salting in Fuerza iónica, (M)

Solubilidad, g/L 100 100 Temperatura, ºC

Peso molecular de las proteínas 1. Métodos primitivos: presión osmótica, ultracentrifugación analítica, etc. 2. Cromatografía de exclusión molecular 3. Electroforesis SDS-PAGE 4. Cálculo directo a partir de estructura primaria

Cromatografía de exclusión molecular

Electroforesis en poliacrilamida-SDS (PAGE)

- - + +

Método de Kjeldahl Digestión ácida total de la proteína y conversión cuantitativa de nitrógeno a NH3, que se valora por titulación. Poco sensible. En desuso. Se sigue empleando para análisis elemental (p.e., alimentos) Proteína total= N x 100/16

Absorción a 280 nm Se fundamenta en la absorción a 280 nm producida por los aminoácidos aromáticos Phe, Tyr y Trp - Sensible y fácil de practicar - Requiere soluciones puras de proteína; no es aplicable a mezclas - Distintas proteínas dan diferente grado de absorción, dependiendo de su contenido en aa. aromáticos

Al tratar con Cu++ en medio alcalino, los compuestos con grupos -CO-NH- dan una coloración violeta. Muy específica; relativamente poco sensible Reacción del biuret

Método de Lowry Reacción en dos fases: 1. Reacción del biuret 2. Tratamiento con reactivo de fenoles de Folin-Ciocalteu - Muy sensible (muestras de 10 mg) y sencillo - Resultados variables con distintas proteínas, pues depende del contenido en aminoácidos aromáticos

Método de Bradford La fijación de un colorante (Azul de Coomassie) a una proteína modifica las características de absorción visible de aquél. Sensible, fácil de practicar y resultados muy constantes 400 500 600 0.2 0.3 0.4 700 Colorante Colorante + proteína l l