Dr. Luis A. Mora B. Cátedra de Bioquímica UCIMED ADN recombinante Dr. Luis A. Mora B. Cátedra de Bioquímica UCIMED

IMPORTANCIA BIOMÉDICA Diagnóstico Medicina forense Terapia génica Producción de medicamentos insulina factores de la coagulación activador del plasminógeno hormona de crecimiento Producción de vacunas Antihepatitis B

IMPORTANCIA BIOMÉDICA Diagnóstico de enfermedades genéticas con cambios en la secuencia de ADN (base molecular de la enfermedad) Hipercolesterolemia familiar Drepanocitosis Talasemias Fibrosis Quística Distrofia Muscular

ESTRUCTURA MOLECULAR DEL ADN Forma (doble hélice de nucleótidos) Componentes (bases nitrogenadas, azúcares, enlaces fosfodiéster) Apareamiento de las bases (A:T, G:C) Pares de bases en genoma haploide humano (3x109) Longitud de genes (3x103) Empacamiento del ADN (histonas)

ESTRUCTURA MOLECULAR DEL ADN

EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN Replicación Transcripción (Exones e intrones) Traducción Síntesis de proteínas

EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE Aislamiento del ADN Desnaturalización Manipulación Endonucleasas Polimerasas Formación de moléculas quiméricas

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN: endonucleasas Endonucleasas: enzimas que cortan enlaces fosfodiéster del material genético a partir de una secuencia de nucleótidos que reconocen (diana de restricción ) ; estos tienen entre 4 y 12 pb. Cortan ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (se leen igual en ambas direcciones). Esto produce dos extremos: romos y cohesivos o escalonados, unidos por ligasas. Arber, Nathans y Smith, 1978, Nobel de Medicina. E. coli. Insulina humana.

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE: endonucleasas Organismos procarióticos (bacterias) Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para distinguir entre el ADN extraño y el ADN propio. No pueden cortar ADN metilado. Isoesquizómeros: de diferentes especies idéntica diana dejan el mismo extremo cohesivo pero no cortan en el mismo sitio.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Las enzimas de restricción al cortar el ADN pueden producir 2 tipos de cortes:   1. Cohesivos o pegajosos:   GAATTC GGATCC AAGCTT CTTAAG CCTAGG AACGAA EcoRI BamHI HindIII 2.  Abruptos: AATATT CCCGGG TTATAA GGGCCC   SspI SmaI

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN: endonucleasas Tipo 1: Restricción (cortan) y modificación (metilan). cortan al azar en sitios distinto (corriente arriba o abajo) dejan extremos cohesivos Necesitan ATP Necesitan de S adenosil metionina (SAM) y Mg+2 como cofactores. Tipo 2: Sólo restricción. otras enzimas metilan.  cortan de manera consistente y predecible en el sitio que reconocen o muy cerca de él. son muy utilizadas en clonación (recuperan secuencias conocidas) sólo requieren Mg+2 como cofactor.   no necesitan ATP. Tipo 3: Enzima oligomérica (realizan todas las actividades) cortan de 25 a 27 pb lejos del sitio restrictivo, dejando extremos cohesivos. requieren dos secuencias de reconocimiento de orientación opuesta en la misma cadena de ADN. Necesitan ATP, Mg y SAM.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Nomenclatura El nombre se asigna según el origen bacteriano. Consiste en: 1)Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo: Escherichia coli (Eco) 2) La cepa o estirpe si la hubiere. ( EcoR, aislada de la cepa RY13 de E. coli ) 3) En números romanos para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de una misma especie. No confundir con el tipo o clase de enzima. 4) Todas deberían llevar delante una R de restricción o M de metilasa según la función pero usualmente se omite.

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE: vectores Definición Vectores Plásmidos bacterianos ADN circular de doble banda Inserción de 6-10 Kb Fagos virales ADN lineal de doble banda inserción de 10-20 Kb Cósmidos Son plásmidos con características de fagos inserción de 35-60 Kb YAC Son cromosomas artificiales de levaduras

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE Propiedades de los vectores Replicaciones independientes del ADN de la célula hospedera Secuencias de ADN conocidas Copias únicas Cromosoma más pequeño que el del hospedero

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

CLONACIÓN Definición: m. Biol. Conjunto de células u organismos genéticamente idénticos, originado por reproducción asexual a partir de una única célula u organismo o por división artificial de estados embrionarios iniciales. m. Biol. Conjunto de fragmentos idénticos de ácido desoxirribonucleico obtenidos a partir de una misma secuencia original.

CLONACIÓN

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