BACTERIAS ODONTOPATÓGENAS Métodos de identificación Profesor: Mg. Angel Vargas Mosqueira Maestría en Periodoncia- USMP E-mail: angelvargas40@hotmail.com

BACTERIAS ODONTOPATÓGENAS Métodos de diagnóstico En esencia los métodos de diagnóstico mas utilizados son: A) Cultivo B) Métodos de inmunodiagnóstico C) Sonda de ADN D) Reacción en Cadena de la Polimerasa: P.C.R E) Enzimología (BANA)

CULTIVO DE BACTERIAS Es el único método válido y que se toma como referencia para determinar la susceptibilidad antimicrobiana in vitro de los periodontopatógenos y es capaz de cuantificar todos los microorganismos viables en una muestra. El cultivo identifica sólo especies vivas a diferencia de los otros métodos. Los medios selectivos contienen sustancias que facilitan la identificación.

BACTERIAS ANAERÓBICAS anaeróbicos estrictos y aerotolerantes Los anaeróbicos estrictos u obligados son destruidos por el oxígeno ya que no pueden eliminar los productos tóxicos derivados del metabolismo del oxígeno ( H2O2, radical O- ) Muchos aneróbicos estrictos son ricos en enzimas flavínicas que reaccionan espontáneamente con el oxígeno para dar estos productos. Los organismos aeróbicos degradan los tóxicos poseen enzimas como superóxidodismutasa y catalasa.

METABOLISMO ANAEROBIO En él se obtiene una menor proporción de energía por el limitado número de sustratos que pueden ser utilizados como fuente de energía Tiene la ventaja de sumistrar energía de forma contínua en tanto exista un sustrato capaz de ser fermentado; o electrones para transferir. Fusobacterium, Prevotella y Porphyromonas no sobreviven más de 10 a 30 minutos en el aire. Actinomyces, Bacteroides y algunos Clostridium son aerotolerantes.Están presentes en la mayoría de procesos infecciosos.

Microbiota de la cavidad oral El sistema ecológico de la boca es muy complejo. La flora bacteriana depende de la edad, estado de la dentición, tipo de alimentación, higiene, cantidad de saliva, el potencial Eh (Redox), la cantidad de lisozima La concentración de bacterias en la saliva es de 108 por ml. de la superficie de los dientes , de 109, de los raspados gingivales puede llegar a 1012. La proporción de anaerobios y aerobios es variable: de 1 a 1 en la saliva y de 1000 a 1 en el surco gingival.

INFECCIONES ANAERÓBICAS Origen: exógeno / endógeno Origen exógeno: botulismo (C. botulinum), Gastroenteritis (C. perfringens), Tétano, Infeción por mordedura de animal o humana. Origen endógeno: Absceso en cualquier órgano, Actinomycosis. Complicación de apendicitis, Endocarditis, Infeción periodontal Las infecciones pueden ser: pulmonares intraabdominales, Abscesos del cerebro, De piel y tejido suave, Orales y dentales

Areas frecuentes afectadas por anaerobios

Procesamiento de la muestra La muestra obtenida asépticamente, debe ser procesada lo que incluye: Cultivo en medio enriquecico y un ambiente anaeróbico (Jarra Gas Pak, Tubo Roll o Cámara anaeróbica). Reconocimiento de las colonias desarrolladas, antibiograma, coloración de Gram. Pruebas bioquímicas: Fermentación de carbohidratos y otras pruebas, para identificar al anaeróbico presente en la muestra.

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA

Relación de las bacterias con el oxígeno Aerobio estricto: Utiliza el oxígeno como aceptor final de electrones. Puede tolerar el oxígeno del aire ( 21%) o aún más. Anaerobio facultativo: Puede crecer bien en ausencia del oxígeno y en O2 al 21% (atmosf.) Microaerófilo: Oxígeno dependiente siempre que sea menor que el de una 1 atmósfera. Anaerobio estricto: No pueden crecer en presencia de oxígeno

Relación de las bacterias con el oxígeno en tioglicolato Tubo 1 : Aeroboio estricto Tubo 2 : Anaerobio facultativo Tubo 3 : Anaerobio aerotolerante (Microaerófilo) Tubo 4: Anaerobio estricto

Algunos medios de cultivo utilizados Brucella agar con 5% de sangre de carnero + vit K y hemina ( son útiles el Schaedler agar o Columbia agar). Bacteroides bili-esculina agar (B. fragilis). Agar sangre con Kanamicina-Vancomicina (Bacteroides) Agar alcohol fenil etílico (inhibe entéricos) Tioglicolato 135 sin indicador, suplementado con Vit K (0.1ug/ml), Hemina (5 ug/ml)

Sistemas para el cultivo de anaeróbicos Los anaeróbicos pueden crecer en las placas de agar, en una atmósfera sin O2, generalmente N2 al 80%, CO2 al 10% e H2 al 10%. El CO2 estimula en crecimiento y el H2 combinado con el O2, que puede estar presente, sirven para mantener las condiciones anaeróbicas. De los sistemas para cultivo de anaeróbicos, el mas común utilliza la técnica de la Jarra Gas Pak. Otros sistemas emplean Cámaras de anaerobios y Medios Pre- reducidos.

Técnica de jarra anaeróbica ( GasPak) Se basa en la remoción del oxígeno presente en la cámara, que ocurre por la reacción con el hidrógeno producido, en presencia de un catalizador: 2 H2 +O2= H2O El catalizador está compuesto de un pellet de aluminio revestido de 0.5% de paladio. Debe ser reemplazado cada vez que se va a cerrar la jarra, pues puede ser inactivado por el SH2 bacteriano u otras sust. volátiles. Se reactiva calentándolo a 160° C por 2 horas.

Sobre generador de GasPak Contiene un papel filtro, una tableta de borohidruro de sodio, una tableta de bicarbonato de sodio y ácido cítrico. El sobre es activado al añadir 10 ml. de agua y el ambiente se obtiene en aproximadamente 30 minutos (condensación de agua en la jarra). Se monitorea colocando una tira de papel filtro con azul de metileno (indicador). El color azul va desapareciendo. En 1 hora el potencial Redox : -100 Mv y en 2 horas: -200 Mv. a 35°C

Jarra GasPak

Jarra Brewer

CAMARA DE ANAEROBIO Es un compartimiento grande de vinil transparente, con los guantes unidos, conteniendo una mezcla de 80% de nitrógeno, 10% de hidrógeno y 10 % de bióxidode carbono, ( el H2 es explosivo) Un compartimiento en un extremo de la cámara contiene dos portillas, una que conduce al exterior y la otra al interior. Los especímenes se ponen en el compartimiento, la portila exterior es cerrada y el aire del compartimiento se evacúa y se sustituye por la mezcla de gas.

Cámara de anaerobios

ANTIBIOGRAMA Se conoce como antibiograma a la prueba de sensibilidad de la bacteria aislada del foco infeccioso, a distintos antibióticos. El objetivo es conocer el antibiótico mas indicado (inhibe el desarrollo de la bacteria), para tratar la infección causada por ella. La lectura se hace midiendo el radio del halo de inhibición ( de acuerdo al MIC). Se pueden probar otras sustancias naturales que tienen acción antimicrobiana.

Prueba de sensibilidad bacteriana a sustancia nueva

Prueba de sensibilidad a sustancia nueva comparada con antibióticos conocidos

Método de identificación enzimológica BANA (Perioscan) BANA (Benzoil-Arginina-Naftil-Amida). Es una prueba que detecta la presencia de una proteasa semejante a la tripsina que lo contienen las bacterias Porphyromonas gingivalis, Treponema dentícola yTannarella forsythensis (Bacteroides fosrythus). Estas bacterias, hidrolizan el sustrato y dan la reación positiva (cambio de color). Se toma la muestra de la placa subgingival con cureta se combina con el reactivo en papel y se incuba a 55°C por 15 minutos.

Métodos de diagnóstico inmunológico Entre los métodos se pueden considerar Inmunofluorescencia directa Inmunofluorescencia indireta Citometría del flujo Aglutinación por látex E.L.I.S.A (enzime-linked inmunoabsorbent assay) Estas técnicas sirven para determinar la naturaleza de las bacterias y calcular los porcentajes en que están presentes. La sensibilidad y especificidad es ligeramente mayor a las del cultivo.

Métodos de inmunodiagnóstico Estos métodos emplean anticuerpos específicos contra antígenos bacterianos. No requiere bacterias vivas y es afectado mucho por la técnica de obtención de la muestra. La fiabilidad depende mucho de los reactivos utilizados. Se ha utilizado la inmunofluorescencia para detectar A. actinomycetemcoimitans y citometría de flujo con anticuerpos monoclonales específicos a lipopolisacáridos para P. Gingivalis.

Técnica de PCR Se basa en una amplificación repetida de una región de ADN flanqueada por un par específico de la especie diana. La presencia de la ampliación indica la presencia del microorganismo. Cuantifica cuando hay de 3 a 5 bacterias y no muestra reacciones cruzadas con otros elementos. Es ideal para microorganismos odontopatógenos. Sus resultados positivos (ante bajo número de bacterias) puede que no tengan significación clínica.

Ventajas de la técnica de PCR Permite amplificar las cadenas de DNA. Para ello lo primero es aislar el DNA de la muestra y posteriormente aplicarle calor para separar ambas cadenas. Tras esto, utilizando DNA polimerasa y un primer o una secuencia conocida de nucleótidos, la muestra es amplificada y posteriormente visualizada. Sirve para el diagnóstico de las principales bacterias odontopatógenas.

La sonda de ADN La sonda de ADN utiliza segmentos de ADN cargados con una enzima o un radioisótopo del correspondiente gérmen diana. Es necesario identificar la especie bacteriana que posee el DNA aislado. Cuando se utiliza toda la secuencia de ADN puede tener reación cruzada con otros gérmenes, es necesario contar con secuencias de oligonucleótidos específicos de especie que eviten esto.

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