Dr: Carlos A Ochoa Chamorro. Biología Molecular. UNAN FAREM-CHONTALES. Febrero 2019.

2) Explicar las principales técnicas de clonación celular. 1) Enunciar las principales aplicaciones clínicas de la clonación celular.

 Enzimas de restricción.  Clonación celular de moléculas de ADN. 1)Preparación del ADN para clonación. 2)Preparación del vector de clonación. 3)Formación de la molécula de ADN recombinante. 4) Tipos de vectores. 5)Incorporación del ADN recombinante a las cls anfitrionas. 6) Propagación en cultivo. 7) Detección y selección de los clones recombinantes. 8) Expresión génica.  Genotecas.

 Características generales.  Papel biológico del sistema metilacion- restriccion.  Acción de las enzimas de restricción tipo II. -Son endodesoxirribonucleasas, tiene elevada especificidad, estabilidad y pureza. -Se nombran con 3 letras tomadas del genero y especies de la bacteria, que puede ir seguida, por una letra mas que identifica el serotipo y finalmente por un # romano

 Es una molécula de ADN artificial formada de manera deliberada in vitro, por la unión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos distintos que normalmente no se encuentran juntos.

 Son moléculas de ADN de doble hebra, de pequeño tamaño(2-5 kb) y forma circular, presentes en forma libre en el citosol de muchas bacterias y en algunas eucariotas unicelulares, permite la incorporación de insertos de ADN de un tamaño máximo de 10kb.  Son fácil es de purificar a partir del cultivo bacteriano. Contienen pocos genes propios.  Comúnmente se utilizan plásmidos artificiales obtenidos a su vez por técnicas de ADN recombinantes.

 Admite insertos mayores que lo que admiten los plásmidos.  Así para clonar en bacterias se usan bacteriófagos, baculovirus para cls de insecto y virus SV40 o retrovirus para cls de mamífero.  Los virus mas comúnmente empleados son los parásitos bacterianos fagos M13 y λ(lambda)

 Son vectores sintéticos que combinan características de plásmidos y fagos.  Son útiles para clonar insertos de gran tamaño (hasta de 45 kb)

 Este tipo de vectores se han diseñado en especial para adaptarse al gran tamaño de insertos requeridos en el genoma humano y de otros mamíferos, y para la clonacion en cls eucariotas.  A) cromosomas artificiales bacterianos.(BACs)  Derivados del plásmido F o el fago P1, pueden aceptar insertos de kb, son vectores adecuados para la elaboración de genotecas eucariotas.  B)cromosomas artificiales de levadura.(YACs)  Pueden aceptar insertos hasta de 1mby se utilizan para preparar genotecas de genoma muy grande o para mantener un gen completo en un único clon.

 Tipos de cls anfitriona. Las cls anfitrionas son cls procarioticas, principalmente de cepa de E.coli. Las cls anfitrionas eucariotas son mas difícil de obtener y mantener, de ellas las mas manejable en cultivo son las levaduras. Cls animales: se pueden citar la cls HeLa del carcinoma epidérmico humano, los fibroblastos NIH de ratón y BHK de riñón de hámster, los ovocitos de ratón etc.  Métodos de introduccion del ADNr

 METODOS DE HIDRIDACION.  METODOS INMUNOQUIMICOS.  METODOS GENETICOS O DE SELECCIÓN FENOTIPICA.

 Se utilizan vectores de expresión

 ES UNA COLECCIÓN DE CLONES FORMADO A PARTIR DE TODOS LOS FRAGMENTOS DE ADN OBTENIDOS PREVIAMENTE POR ESCISION DEL GENOMA DE UNA ESPECIE O DE UN TEJIDO.  Se clasifican en genotecas genomicas y genotecas de ADN complementario.

 BIOLOGIA MOLECULAR Y INGENIERIA GENETICA. JOSE LUQUEZ, ANGEL HERRAEZ.  PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA DE HORTON, CUARTA EDICION.  GENETICA EN MEDICINA. THOMPSON Y THOMPSON, SEPTIMA EDICION.  LEHNINGER. PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA. QUINTA EDICION.  BIOLOGIA MOLECULAR DE LOS GENES, SEPTIMA EDICION. WATSON