Jefe de proyecto: Ma. Teresa Orta de Velásquez Participantes Identificación de subproductos y posibles daños celulares en Helicobacter pylori por acción del cloro y el ozono en agua potable. Jefe de proyecto: Ma. Teresa Orta de Velásquez Participantes Académicos: M. en C. Isaura Yáñez Noguez, Dr. Ignacio Monje Ramírez, Fac. de medicina: Dra. Yolanda López Vidal, Dr. Gonzalo Castillo Becarios: Maestría. Beatriz Casasola Rodríguez Licenciatura. Priscila Ivette Román Román Marié Andreé Pierdat Gallardo Salvador Rangel Guadalupe Proyecto Interno: 9361 Vigencia: 2010-2011

Helicobacter pylori Helicobacter pylori es una bacteria asociada a gastritis crónica y adenocarcinoma. Gram (-) 2-6 flagelos unipolares 2 formas morfológicas (cocoide, bacilar) Forma colonias translucidas de 1 mm Microaerofílica (2-5% O2 y 5-10% CO2) el O2 es su aceptor final de electrones Temperatura óptima 37 º C Neutrófila con crecimiento óptimo pH: 5.5-8 Requiere medios complejos, complementados con agar sangre y suplementos Dent y Skirrow Es detectada al agregar trifeniltetrazolio (TTC) Ureasa, catalasa y oxidasa (+) Cataboliza glucosa solamente Aminoácidos y urea, fuente de nitrógeno

Debido a su importancia, ha cobrado interés a nivel mundial: En 1994 (IARC) y (OMS), lo clasificaron como carcinógeno de clase I dentro de los agentes causales. 2005 Marshall y Warren obtuvieron el premio nobel en medicina por el descubrimiento de la implicación de la bacteria en úlceras pépticas y gástricas. *OMS 2008 México Mundial

20% desarrollará cáncer gástrico 50% de la población mundial está infectada 80% en países en desarrollo Infectados con H. pylori 20% desarrollará cáncer gástrico 20% desarrollarán úlcera péptica.

Formas morfológicas transmisibles de H. pylori En cuerpo humano y condiciones de laboratorio Bacilar Apta para pruebas médicas Viable , Cultivable. Forma resistente en el ambiente acuático Cocoide Apta para pruebas de desinfección en condiciones naturales Viable no cultivable (VNC) No viable Azevedo et al. 2007 proponen que la forma cocoide es la forma en la que la bacteria se encuentre en el medio ambiente

Detección Inmunoensayo enzimático Prueba de actividad de ureasa Debido a que la forma (VNC) es la que se encuentra presente en los sistemas acuáticos, se utilizan diversos métodos que no involucran el crecimiento de la bacteria. Inmunoensayo enzimático Prueba de actividad de ureasa Hibridación fluorescente in situ FISH: (Fluorescent In Situ Hybridization) PCR (polymerase chain reaction) en tiempo real PCR Técnica cuantitativa PCR Detecta en tiempo real la amplificación de nuestro genoma de interés.

Se ha detectado HELICOBACTER PYLORI en: Agua superficial (Cutzamala). Agua residual tratada usada para riego (Xochimilco). Agua residual sin tratamiento (Gran Canal/Río de los Remedios).

Cloro Ozono Métodos más empleados para Desinfección Económico y eficaz Hipoclorito y monocloramina (NH2Cl) Ozono Económico y eficaz Buenas propiedades residuales 1.1 mg/L residual Formación de trihalometanos en presencia de materia orgánica (vegetal o animal) - Bromoformo - Cloroformo Alto potencial de oxidación Rápida descomposición 0.1-0.4 mg/L residual Formación de subproductos en presencia de materia orgánica y bromuros. -Bromato (25 μg/L) -Bromoformo

Desinfección Daño en membrana H. pylori ha mostrado resistencia a los niveles habituales de cloro, por lo que la bacteria puede permanecer viable el tiempo suficiente para llegar a la población. Buscar alternativas eficaces en los procesos de tratamiento de agua potable y de reuso. El tratamiento con ozono es una tecnología factible de desinfección (Thanomsub 2002). Usó cultivos aplicando altos tiempos de contacto. Daño en membrana

OBJETIVO Establecer las dosis del ozono y cloro, así como tiempos de contacto necesarios para inactivar la bacteria H. pylori inoculada en una muestra sintética y en agua de pozo. Objetivos específicos: Cuantificar la densidad celular de H. pylori, para determinar la inactivación aplicando la técnica de PCR en tiempo real. Determinar posibles alteraciones en el DNA de H. pylori aplicando la técnica de PCR el tiempo real. Determinar posibles alteraciones en la estructura celular de H. pylori por medio de microscopía electrónica. Evaluar subproductos derivados de la desinfección con ozono . Helicobacter pylori

METODOLOGÍA Suspensión bacteriana En agua Concentración conocida con PCR-tiempo real Micrografía electrónica Desinfección con cloro y ozono Medición de concentración de la densidad con PCR-tiempo real Medición de subproductos por cromatografía de gases Daño en membrana 13 ml de agua 6x106 UFC de H. pylori 3 min 5 min 10 min

Determinación de la solubilidad del ozono en agua destilada Resultados Determinación de la solubilidad del ozono en agua destilada Para realizar los ensayos de desinfección fue necesario obtener una solución acuosa saturada de ozono, ya que no es posible ozonizar directamente las muestras sintéticas con H. pylori. Debido a que se trabaja con volúmenes muy pequeños de agua y las dosis de ozono son bajas.

Se realizaron diferentes ensayos, sin embargo no se observó crecimiento bacteriano en ninguna de las placas de agar. Probablemente la bacteria sufre lisis por choque osmótico al entrar en contacto con el agua destilada. Se efectuó el mismo ensayo, sustituyendo el agua destilada por Solución Salina Isotónica para determinar tiempo de vida de la forma bacilar de H. pylori en ella, sin embargo tampoco se obtuvo crecimiento de H. pylori en ninguna de las placas. Se determinó un tiempo de vida corto de la forma bacilar de H. pylori en agua destilada. Debido a los resultados obtenidos se evaluó la posibilidad de trabajar con las formas cocoides, ya que estas son las que se encuentran en medios acuáticos como forma de resistencia de la forma bacilar de H. pylori. El Dr. Castillo de la Facultad de medicina recomendó promover las formas cocoides y realizar los ensayos de desinfección dentro de un periodo de 22 días posteriores.

Suspensión celulares con 3x105 UFC/mL RESULTADOS Obtención de las formas cocoides Helicobacter pylori será proporcionada por la Facultad de Medicina (UNAM. 26695) Suspensión celulares con 3x105 UFC/mL Se incubó a temperatura ambiente en condiciones aeróbicas para inducir la transformación de las formas bacilares a formas cocoides. Se realizaron tinciones de Gram de las 3 suspensiones a los 5, 6 ,7 y 10 días. En todos los casos se observaron formas bacilares y formas cocoides, pero las estructuras cocoides fueron aumentando progresivamente y cada vez se observaron menos formas bacilares. Al décimo día se obtuvo una suspensión que contiene más del 80% de las formas cocoides. (Tinción Gram) Con esta suspensión se pretende trabajar para realizar los ensayos de desinfección. Los resultados que se obtengan serán de mayor relevancia debido a que las formas cocoides de Helicobacter pylori juegan un papel importante en el proceso de transmisión por su capacidad de persistencia en ambientes acuáticos. Bacilar Cocoide

ACTIVIDADES SEGUNDO AÑO Suspensión bacteriana FORMAS COCOIDES Concentración inicial con PCR-tiempo real Micrografía electrónica Desinfección con cloro y ozono Medición de concentración con PCR-tiempo real Medición de subproductos por cromatografía de gases Daño en membrana Genotoxicidad