Reemplazar el uso de petróleo Reducir la generación de CO2 Tecnología simple y eficiente Extraer y fermentar los azucares presentes en lignocelulosa.

Fuentes alternas de azúcares fermentables: celulosa y hemicelulosas. El futuro de la industria del bioetanol dependerá de múltiples “biotecnologías” entre otras: Alto rendimiento de maíz (OGM). Almidón: recuperación y estructura. Diseño y producción de enzimas amilolíticas. Microorganismos modificados para una fermentación eficiente. Recuperación de etanol a través de bioprocesos de alta eficiencia. Fuentes alternas de azúcares fermentables: celulosa y hemicelulosas.

Desarrollo de nuevos biocatalizadores etanologénicos HEXOSAS + PENTOSAS Embden-Meyerhof-Parnas Entner-Doudoroff Vía de las Pentosas PDH (0.4 mM) PIRUVATO TCA Piruvato Decarboxilasa (0.4mM) (PDC) Acetaldehído +CO2 Alcohol Deshidrogenasa II (ADHII) Zymomonas mobilis LDH (7 mM) PFL (2 mM) Lactato Acetyl-CoA + Formato Acetato Etanol CO2 H2 Etanol

Características del sustrato Principal componente estructural de los vegetales La celulosa es un polisacárido formado por unidades de glucosa unidas mediante enlaces β-1,4 glucosídicos. La configuración β le permite a la celulosa formar cadenas largas, lineales y paralelas, unidas entre sí formando una estructura cristalina y organizada.

La mayor parte de la “fase amorfa” de celulosa corresponde a las cadenas que se encuentran en la superficie de la estructura mientras que los componentes cristalinos ocupan el núcleo

CELULASAS Complejo enzimático que hidroliza los enlaces b- glucosídicos en la celulosa. Formado por: endo-β-1,4-glucanasa (EC 3.2.1.4) (Cx) exo-β-1,4-glucanasa (celobiohidrolasa EC 3.2.1.19) (C1) β-glucosidasa (celobiasa EC 3.4.1.21) (Cb)

MECANISMO ENZIMÁTICO 1. La endo β-1,4-glucanasa actúa al azar sobre los enlaces β-1,4 glucosídicos de la celulosa de las zonas amorfas y la conviente en oligosacáridos. endo β-1,4-glucanasa

MECANISMO ENZIMÁTICO 2. La exo β-1,4-glucanasa, o celobiohidrolasa, es una enzima que corta la cadena 1,4 β-D-glucano a partir del extremo no reductor de la molécula de celulosa y de las celodextrinas, lo que provoca la remoción de unidades de celobiosa (2 moléculas de glucosa)

CBH de T. reesei

MECANISMO ENZIMÁTICO 3. La β-glucosidasa o celobiasa rompe el enlace b de la molécula de celobiosa, para obtener moléculas de glucosa celobiasa

Sinergísticamente después de la endo- actúa la exo β-1,4-glucanasa que corta la cadena a partir del extremo no reductor de la molécula de celulosa, lo que provoca la remoción de unidades de celobiosa. Ambas enzimas Endoglucanasa y Exoglucanasa son inhibidas por la celobiosa, lo que disminuye la eficiencia de la hidrólisis. Una vez degradadas las zonas amorfas de la celulosa, la región cristalina comienza a ser hidrolizada como resultado de la acción sinergística de la endoglucanasa y la exoglucanasa. La degradación de la celobiosa a glucosa mediante la acción de la β-1,4-glucosidasa es requrida para desinhibir a las otras enzimas La hipótesis C1-Cx se propuso para explicar la acción de las celulasas de hongos en la hidrólisis de la celulosa, en ella se denota a los componentes de la celulasa como C1 (a la CBH) y como Cx (a la EG), también se considera al componente βG (β-glucosidasa), el cual completa la hidrólisis de las cadenas cortas de oligosacáridos a celobiosa y glucosa.

EXOCELULASA: Actúa en el extremo no reductor, obteniendo glucosas de la cadena de celulosa. exocelulasa

Transferencia de la mayor parte de las enzimas en fase acuosa a la superficie de las partículas de celulosa. (2) Adsorción de las enzimas y la formación de complejos enzima-sustrato (ES). (3) Hidrólisis . (4) Transferencia de la celulodextrinas, la glucosa y la celobiosa, desde la superficie de las partículas de celulosa a la fase acuosa. (5) Hidrólisis de celulodextrinas y celobiosa en glucosa en la fase acuosa. La adsorción de las enzimas y la formación de complejos enzima-sustrato se consideran los pasos críticos en la hidrólisis enzimática de celulosa. Una vez degradada las zonas amorfas de la celulosa, tiene lugar la hidrólisis de la región cristalina como resultado de la acción sinergística de la endoglucanasa y la exoglucanasa.

Métodos de análisis de actividad enzimática Papel filtro Cantidad de azúcar que se forma en 1 hora cuando 50 mg de papel filtro Whatman #1 se incuba con 0.5 mL de enzima a pH 4.8 (buffer de citratos) en un vol. total de 1.5 mL Determinación viscosimétrica Soluciones de CMC y Hidroxietilcelulosa (generan alta viscosidad), la adición de celulasas disminuye la viscosidad del medio (actividad con HEC normalizadas) Actividad sobre celobiosa; Medición de poder reductor. Avicel (micro-partículas cristalinas de celulosa), posee un menor grado de polimerización y una mayor número de extremos libres en comparación con el algodón.

Microorganismos productores de celulasas Las enzimas celulasas son producidas por una variedad de bacterias y hongos. Sin embargo, sólo algunos de ellos producen celulasa extracelular capaz de hidrolizar la celulosa.

Fuentes de celulasas Trichoderma viride Fungales Trichoderma reesei Penicillum koningii Cellulomonas sp Celvibrio sp. Bacterias Microbispora bispora Therninibispora sp

Aerobios mesófilos fungales Trichoderma viride Trichoderma reesei Penicillium pinophilum Sporotrichum pulverulentum Fusarium solani Talaromyces emersonii Trichoderma koningii

Trichoderma viride Aparecen en cualquier tipo de suelo, produciendo colonias blancas, amarilla o más típicamente verdes cuando se cultivan.

Actividad específica de T.viride con diferentes sustratos Enzima Actividad específica (mg/mL*min) CMC Avicel Endoglucanasa I 17 19.4 Endoglucanasa II 2.5 0.6 Endoglucanasa III 1.2 2.3 Exoglucanasa 1.0 1.7

Propiedades fisicoquímicas de las enzimas T. optima (°C) pH óptimo Carbohidratos (%) Peso molecular (Da) Endoglucanasa I 53-58 4.5 20.9 51,000 Endoglucanasa II 58 4.7-5.3 2.3 59,000 Endoglucanasa III 5.0-55 3.5-3.9 10.0 41,000 Exoglucanasa 70 4.9-5.2 5.8 62,000

Método Koji

Otros Mohos y Bacterias productoras Sporotrichum thermophile Neocallimastix frontalis Piromonas communis Cellulomonas sp Acetivibrio cellulolyticus Clostridium thermocellum

Las celulasas brindan una forma efectiva de degradar tejidos, aunque es mejor si se usa en combinación con otras enzimas hidrolíticas. ¿Cuáles?

Preparados enzimáticos comerciales: Crystalzyme PML-MX de Valley Research Inc. Biocellulase A de Quest Intl. Celluclast 1.5 L de Novo Nordisk. Econase Ce-S de Enzyme Development Co. Cellulase AP30K de Amano Enzyme. Zymafilt L-300 y Macerex de Enmex S.A. de C.V. Novozym 342 de Novo Industries. Cellubrix L de Novo Nordisk. Cellulase de Bio-Cat Inc.

Genencor launches first ever commercial enzyme product for cellulose ethanol Genencor, a division of Danisco A/S, has announced a biomass enzyme developed specifically for second generation biorefineries called Accellerase™ 1000. The product is a mixture of enzymes that reduces complex lignocellulosic biomass into fermentable sugars -- a step in the production of cellulosic ethanol. Genencor has been developing its biomass enzymes for well over 10 years. The effort was partially supported by contracts with the US Department of Energy’s (DOE) National Renewable Energy Laboratory (NREL). Commercial interest in second generation biorefineries, driven in part by government policies to reduce the emission of greenhouse gases and increase energy independence, has accelerated over the past two years in the USA and around the world. “The biofuels industry is at an inflection point with the development of cellulosic ethanol plants at the pilot and demonstration scale,” “Every biorefinery developer needs to know how enzymes will work in their system. This product aims to address that need and to start a dialogue with potential partners about customized solutions and supply at the industrial scale.”

Cellulase enzyme gets GRAS for beverages 05-Oct-2009 Related topics: Industry The FDA has raised no objections to Florida-based Dyadic International’s GRAS application for it cellulase enzyme derived from a GM strain of its patented and proprietary C1 organism. A new liquid enzyme product produced from its C1 technology platform called CeluStar CL will be immediately offered for sale for use in the production of wine, beer and fruit juices, said the company. “Receiving this positive acknowledgement from the FDA regarding our GRAS notification culminates a multi-year product development process and affirms Dyadic's conclusion that its cellulase enzyme is safe for use by our customers. Dyadic intends to continue to utilize its C1 technology platform for the development of additional specialty enzyme products,” said Richard Jundzil, Dyadic's director of development & quality. The GRAS notice is number: GRN 000292.

Extracción de jugo En la extracción de jugo con preparados enzimáticos se incrementa el rendimiento y la calidad del jugo, así como la diversidad de componentes. El pretratamiento de la pulpa con enzimas provoca un aumento en el contenido de los sólidos solubles comparado con una muestra testigo (sin enzima)

MACERACION ENZIMATICA La ventaja de la maceración enzimática radica en que las enzimas rompan la pared de las células, provocando así un ablandamiento del tejido y facilitando la extracción. Se facilita por tanto la extracción del jugo durante el procesamiento industrial, además de que permite mejorar la palatabilidad del jugo.

Extracción de leche de coco La degradación enzimática con el preparado Trizyme P50 de Triton Chemicals ha mostrado una extracción total de la leche de coco. Los azúcares, principalmente la glucosa que es producto de la degradación de los polisacáridos, permitió obtener una leche de coco con un mejor sabor, debido a que le imparten mayor dulzura a la leche.

Extracción de aceites El rendimiento del aceite de aguacate aumenta hasta un 30 % después de someter la pulpa de aguacate a un proceso de extracción acuosa enzimática con los preparados comerciales Ultra-SP-L y Olivex. En las soya también se ve un aumento de la cantidad de aceite extraído cuando se trata enzimáticamente pasando de un 82.2% a un 99% de extracción.

COST ANALYSIS OF ENZYME PROGRAME ASSUMPTIONS Genencor CytolaseTM104@ $22.00/Kg Extra Virgin Olive Oil value is about $5.30/L Virgin Olive Oil value is about $4.00/L Olive Oil yield without enzymes is typically 125 L/1000 Kg of olives. % Oil Yield Increase Requiered to Justify Enzyme Use Dosaje Enzyme % Aprox. Enzyme Cost/1000 Kg Olives Extra Virgin Oil Virgin Oil 0.1 $22 3.3 4.4 0.2 $44 6.7 8.9 0.5 $110 16.7 22.2

POTENCIAL EN BIOCOMBUSTIBLES Desarrollo de tecnología para la obtención de biocombustibles , bioetanol, a partir de residuos celulósicos (bagazo, paja, papel, etc)

Iogen, an enzymes producer that operates the world's only cellulose ethanol facility. The plant, in Ontario, has the capacity to make 3 million to 4 million L of ethanol per year by breaking down and fermenting about 40 tons per day of wheat, oat, and barley straw with steam, enzymes, and yeast. In 2004, Iogen became the first company to produce large quantities of cellulosic ethanol, about 1 million gal per year from wheat straw, at a demonstration plant in Ottawa. Iogen has plans to begin construction in 2007, either in the U.S. or in Canada, on a commercial-scale plant that will produce 40 million gal per year of cellulosic ethanol. Iogen also has partnered with Volkswagen and Royal Dutch/Shell to explore cellulosic ethanol production in Germany. Bush's latest speech promoting the inclusion of $150 million in next year's federal budget for research into new ways of making ethanol. Extra development work has brought about a significant reduction in the enzyme cost of ethanol production using corn stover, in Novozymes' case from more than $5.00 per gal to between 10 and 18 cents per gal.

The new energy law includes a federal renewable fuels standard that requires 7.5 billion gal per year of ethanol be blended with gasoline by 2012. Currently, about 12 billion gal of ethanol is produced worldwide and about 4 billion gal in the U.S., nearly all of it made from cornstarch. Overall, the global bioethanol market is expected to grow to nearly 30 billion gal annually by 2020, according to the Renewable Fuels Association.

Composition and proporties of marigold petal carotenoids % Rf-valuea Visible absorption in CS2, nm Lutein dipalmitate Lutein dimyristate Lutein monoesters Total Unknowns (by difference) 52.1 31.2 6.3 89.6 10.4 0.46 0.45 0.10 ------ 474 505 475 506 -----

Production of colorants from Marigold Flowers Cultivation of marigold plants Harvesting of Marigold flowers Silage Pressing drying Cell dryer Dry flowers Milling Marigold meal Pelleting Hexane extraction Oleoresin Hidrolysis Purification Stabilization & Stabilization & Poultry Products Human Consumption Products

Overall extraction yield 95% Enzyme requeriments as a function of flower freshness (higher dosis to avoid silage) Optimization of type, concentration, addition mode and reaction conditions (temperature) of the enzyme system. Preincubation Relation Hexane/mass of flowers Control of water concentration Succesive extractions Type of agitation Higher concentration of Xantophylls in oleoresin Higher yields and less extraction steps Avoid contamination during silage