Fiebre Malta Curso: Inmunología Aplicada al Laboratorio Clínico Brucelosis Profesor: Mg. T.M. César Alfonso Champa Guevara Fecha: 27/04/2019

GENERALIDADES La isla de Malta famosa en la Edad Media por las cruzadas. Posteriormente S. XVII y XVIII pasó a ser colonia inglesa Caballeros de las cruzadas sufrían fiebres altas recurrentes. Así, en 1863 Marston lo llama Fiebre de Malta. Aparece en otras zonas mediterráneas pero se distingue la Fiebre de Malta familiar de fiebre mediterránea. 1886, Bruce vio que hombres y animales la padecían al ser infectados por Brucella. Sangre de éstos producía aglutinación con el Ag de la Brucella fue descubierto por Wright. El hombre no la padece espontáneamente y no se trasmite de hombre a hombre por eso, en algunos países no aparece.

GENERALIDADES Esta enfermedad es también conocida como Fiebre de Malta Descubierta en 1887 en esta isla mediterránea (Fiebre mediterránea) Soldados británicos en guarnición enfermos con fiebre por causa de la bacteria a la que se dio más tarde el nombre de Brucella (en honor de su descubridor el médico militar inglés David Bruce). Otras denominaciones alternativas para la Brucelosis, antiguamente utilizadas, han sido Fiebre ondulante, Fiebre recurrente y Melitococia.

AÑO Principales descubrimientos en la brucelosis InvestigadorHallazgo 1860J.A. Marston Primera descripción detallada de la fiebre de Malta D. Bruce, M.E. Bruce y Carruana- Sechuna Descubrieron al agente causal de la fiebre de Malta. Lo cultivaron e identificaron macro y microscópicamente como Micrococcus melitensis. 1897M. L. Hughes Escribió y publicó una monografía de la fiebre ondulante. 1897A. E. Wright Se introdujo la reacción de aglutinación para el diagnóstico serológico de la cemia por Micrococcus melitensis. 1905T. Zammit Descubrió que las cabras eran la fuente de infección de la fiebre de Malta. Principales descubrimientos en la brucelosis.

ETIOLOGIAETIOLOGIA Agente Patógeno Reino: Bacteria. Filo: Proteobacteria. Clase: Proteobacteria alfa Orden: Rhizobiales Familia: Brucellaceae ( por µm) Brucella abortus

Agente Patógeno FMN Fagocitan Fagocitadas Sobrev y multiplic Trasportadas G.L Placnt

Etiología Es una zoonosis Producida bacterias del género Brucella Brucella pequeños cocos y cocobacilos gramnegativos aeróbicos, inmóviles y de crecimiento lento. B. melitensis, B. suis, B. abortus, B. canis, B. neotomae, B. ovis En 2008 se reportó la 9na especie del género: Brucella microti La especie más dañina e infecciosa es B. melitensis,(cabras y ovejas) causa la mayor sintomatología y la más difícil de tratar. Brucella abortus es el microorganismo implicado con mayor frecuencia en la brucelosis bovina. Brucella suis afecta primariamente al ganado porcino. Las tres especies menores (B. canis, B. ovis y B. Neotomae) no revisten importancia en patología humana.

Patogenicidad La virulencia de las brucelas está en función de la presencia de lipopolisacáridos (LPS), en su superficie Las cepas lisas son más virulentas que las rugosas debido a su abundante cantidad de LPS. Período de incubación 5 días a meses, promedio 2 semanas

Epidemiología Reservorios naturales: bovinos, caprinos, ovinos, cerdos Se han encontrado brucellas en mamíferos como pequeños roedores, cánidos, camélidos y cetáceos. La vías de contagio: mucosas, heridas en la piel y la vía digestiva. La bacteria puede incluso entrar por las vías respiratorias mediante aerosoles. Muchas infecciones provienen de la manipulación de animales contaminados, por ingesta de leche o de sus productos no pasteurizados y de carnes poco cocidas. En países desarrollados es una enfermedad típicamente ocupacional donde las personas más expuestas son veterinarios, peones de campo y trabajadores de la industria de la carne.

14Brucella Epidemiología

Epidemiologia Brucelosis: Sinónimos fiebre ondulante, fiebre melitensis, fiebre de Malta, fiebre de Traum, fiebre caprina, fiebre de Chipre, fiebre de Bang, fiebre de Gibraltar, fiebre sudoralis. Ataca a muchas especies de mamíferos: al hombre, causando la brucelosis humana. También infecta a otros mamíferos, algunos con alta relevancia económica: los ganados bovino, equino, porcino, ovino y caprino y a otras especies silvestres. La relación causal entre el organismo y la enfermedad fue establecida por Dr. David Bruce (microbiólogo) en Se llama así en honor de David Bruce, médico militar que en 1887 aisló el agente patógeno del bazo de soldados británicos acuartelados en la isla de Malta. La bacteria recibió el epíteto del nombre latino de la isla: Microccocus melitensis (hoy, Brucella melitensis).

P atogenia Varias circunstancias hacen a Brucella especial desde el punto de vista patogénico. En primer lugar, la virulencia de Brucella no tiene factores de virulencia clásicos de otros gérmenes: exotoxinas o endotoxinas. En segundo lugar, Brucella consigue invadir y persistir en el interior de las células mediante la inhibición de los mecanismos celulares de muerte celular programada (apoptosis). La infección tiene lugar por contacto, consumo o inhalación de material infectado. La contaminación de las mucosas se sigue de su fagocitosis, dos componentes de su superficie relacionados con los receptores histidina kinasa (BvrS/BvrR) se relacionan con el proceso de internalización de Brucella.

18Brucella Transmisión Por contacto directo con animales enfermos Inoculación e inhalación Ingestión Conjuntivas, por aerosoles o autoinoculación Periodo de incubación.- de 1 a 6 semanas

19Brucella

Variedades de Brucella que infectan al hombre: ESPECIES BRUCELLA HUESPED NATURAL ENFERMEDAD CLINICA B. melitensis Cabra, oveja Enfermedad grave aguda y complicaciones comunes B. abortusVaca Enfermedad leve y complicaciones supuradas raras B. suis Cerdo, roedores Enfermedad supurada destructiva con manifestaciones crónicas B. canis Perro Enfermedad leve y complicaciones supuradas raras No infectan al hombre: B. ovisOveja B. neotomaeRoedores

21Brucella SIGNOS Y SÍNTOMAS Fiebre, escalofrío, diaforesis Cefalea Mialgias Artralgias principalmente de columna vertebral Anorexia, pérdida de peso, fatiga Hepato-esplenomegalia, ictericia Exantema

Manifestaciones clínicas En el hombre, su sintomatología inicial es:  Fiebre  Cefalea  Dolor vertebral con afectación de las articulaciones sacro ilíacas Adenopatias(inflamación de los ganglios) en el 50% de los afectados.  En casos más graves puede producir endocarditis y neumonia.  La fiebre suele subir durante la noche y disminuir durante el día, con períodos de oscilación (de ahí que se dé el nombre de fiebre ondulante a la enfermedad).

 La brucelosis presenta manifestaciones clínicas polimorfas, a veces es asintomática.  La gravedad depende de la presencia de enfermedad subyacente, del estado inmunitario del huésped y de la especie de Brucella, así B. Mellitensis y en menor grado B. suis suele producir una enfermedad más grave que B. abortus y B. canis.  El período de incubación es variable: 1 y 3 semanas.  La evolución espontánea de la fiebre no sigue ningún patrón en mayoría de casos, y aunque se conoció inicialmente como fiebre ondulante, este rasgo se observa en la clínica con muy poca frecuencia, es habitual la presencia de fiebre mantenida durante varias semanas con ascensos vespertinos, o bien la presencia de fiebre continua durante algunos días, que posteriormente se autolimita.  Los signos físicos más habituales: presencia adenopatías en un 12%-20% de los casos y hepato-esplenomegalia 30%-50%.

Formas focalizadas o complicaciones Están entre 1%-30% de enfermos, sobretodo en aquellos en los que el diagnóstico y el tratamiento se retrasa. Las formas mas frecuentes son: Osteoarticular (20%-35%): sacroileitis, artritis periféricas y espondilitis. Genitourinarias (2%-20%): SNC (2%-5%): meningitis aguda o meningoencefalitis, encefalitis, etc. Endocarditis: Es la mayor causa de muerte en pacientes con brucelosis, aunque es poco habitual (menos del 2% de los casos). Se afectan tanto válvulas sanas como previamente dañadas. Absceso hepático (1%): Usual elevación de enzimas hepáticas en los primeros estadios de la enfermedad (30%-60% de los pacientes), hepatomegalia en un porcentaje inferior. Otras: incluyen abscesos esplénicos, tiroides o epidurales. Neumonitis, derrame pleural, empiema, colecistitis, uveítis e infección de prótesis y marcapasos.

Recidiva En los seis primeros meses de la infección inicial tratada, aunque pueden aparecer hasta los 12 a 18 post- tratamiento. Cuadro clínico similar al inicial, de menor gravedad. Las pruebas de diagnostico serológico no son útiles. El aislamiento del germen es por hemocultivo. Los factores asociado con un riesgo elevado de padecer recidiva han sido la elección de un tratamiento "menos efectivo", la presencia de hemocultivos positivos en el momento del diagnóstico, la duración de los síntomas antes de la iniciación del tratamiento menor de 10 días, fiebre de más de 38,3 ºC, así como el sexo masculino y una cifra de plaquetas inferior a /mcl. Reaparición de una enfermedad algún tiempo después de padecida.

Reinfección Hay alguna forma de inmunidad duradera. Es frecuente observar la presencia de episodios de reinfección. En aquellas personas en situación de riesgo. Es el caso de veterinarios, trabajadores de la lana o de mataderos y sobre todo de pastores. Brucelosis crónica No hay definición uniforme de este cuadro. Pacientes cuya enfermedad lleva un período de evolución superior a los 6 meses. No debería aplicarse a situaciones clínicas solapadas, formas localizadas o para referirse a pacientes que presentan síntomas inespecíficos mucho tiempo después de finalizado el tratamiento, mientras sus títulos serológicos se han negativizado.

Prueba de aglutinación en suero Diagnóstico de Laboratorio Diagnóstico de Laboratorio Prueba de fijación al complemento (FC) ELISA inmunoanalisis enzimático Microbiología Frotis directos Histología Placenta – riñón – pulmón – bazo – carúncula materna – encéfalo - hígado

Diagnóstico de Laboratorio Con cuadro clínico sugerente, aunque inespecífico, con antecedente epidemiológico de exposición al germen, debe hacer sospechar la presencia de brucelosis. Diagnóstico directo Cultivo.  El aislamiento y la identificación del germen en la sangre, médula ósea u otros tejidos es el método definitivo.

 La muestra biológica de elección es el hemocultivo.  Positivo entre el 70-85% de los casos.  Al ser un germen de crecimiento lento, los cultivos en medios bifásicos suele ser positivos entre el 7 y el 21 día, algunos hasta 35 días. Actualmente en los laboratorios de microbiología emplean métodos automatizados de aislamiento rápido (BACTEC) que son examinados al 5-7 día y si no se realizan subcultivos de las botellas negativas, es poco probable aislar el germen.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).  Método rápido, sensible y específico, detecta género y especie, sintetiza o copia “in vitro” secuencias específicas de ADN bacteriano.  Trabajos de PCR en sangre, tanto en dx de la fase inicial como en evaluación del seguimiento y de las recaídas la prueba, sensibilidad (100%) y especificidad (98,5%), de fácil y rápida ejecución.  Los resultados no se ha confirmado otros autores y la interferencia de elementos hemáticos es factor limitante de sensibilidad.

 Negatividad de hemocultivos en un grupo importante de pacientes, de evolución prolongada, y falta de criterios serológicos claros de curación de la enfermedad, plantean problemas en el seguimiento clínico de pacientes con sospecha de recaída o de evolución crónica.  La cuantificación de la carga bacteriana puede ser una ayuda en el seguimiento y en la detección precoz de recaídas o fallos en el tto. En estos casos la PCR, tanto la convencional como la cuantitativa (PCR-Q) es de gran utilidad, y es posible que en un futuro próximo se consolide como un método eficaz de confirmación bacteriológica y seguimiento de la brucelosis.

Diagnóstico indirecto El diagnóstico serológico: presencia de Ac dirigidos frente a antígenos de la pared de la Brucella. Entre la 2ª y 3ª semana después del inóculo: anticuerpos aglutinantes dirigidos frente al antígeno lipopolisacárido. Posteriormente, aparecen Ac con poca o nula capacidad aglutinante que son detectados por la prueba de Coombs antibrucela. Los Ac suelen persistir durante un periodo prolongado tras la recuperación clínica.

Rosa de Bengala. Aglutinación en placa, que se considera ideal como técnica para el diagnóstico inicial de la brucelosis y como prueba de cribaje por su rapidez y bajo costo. Muestra una correlación absoluta con la seroaglutina. Sus falsos negativos se limitan a enfermos con procesos de pocos días de evolución y a algunos casos de enfermedad de curso muy prolongado.

Pruebas serológicas Rosa de Bengala Prueba de antígeno tamponado o de tarjeta Tomar de 7 a 10 cc de sangre en tubos al vacío, sin preservativo o aditivo alguno, remitiéndolos en el menor tiempo al laboratorio.

Aglutinación en tubo o placa (aglutinación de Wright, aglutinación estándar, SAT). Valiosa por su sencillez, sensibilidad, especificidad y es la más utilizada. Es específica, no existe un título definitivo indicativo de infección. Un título de 1:100 o mayor se considera, el punto de corte en el diagnóstico de la enfermedad. Interpretación: antecedentes del enfermo y valorar las características clínicas presentes puesto que, al inicio de la enfermedad o, la prueba puede ser, como el Rosa de Bengala, negativa. Ac responsables de la clase IgM, lo habitual es que vayan descendiendo en el transcurso de 3-6 meses, con o sin curación de la enfermedad.

Aglutinación en tubo o placa (aglutinación de Wright, aglutinación estándar, SAT). El antígeno empleado en al Prueba de Aglutinación de Brucella (SAT) procede la B. abortus; los anticuerpos frente a B. melitensis o B. suis presentan reactividad cruzada con dicho antígeno.

Seroaglutinatinación previo tratamiento del suero con 2-mercaptoetanol. Modificación de la seroaglutinación de Wright y se usa 2-ME. Este compuesto es capaz de destruir las moléculas de IgM, perdiendo éstas su capacidad aglutinante, sin interferir con IgG que son las que se cuantifican. Un título de 1:200 o mayor sugestivo de infección por Brucella.

Coombs antibrucela.  Detecta anticuerpos con poca o nula capacidad aglutinante, IgG.  El suero de Coombs (Inmunoglobulina Humana) facilita la aglutinación de los Ac no aglutinantes del suero problema, fijados a la suspensión antigénica de B. abortus.  Ac pueden persistir en ocasiones de forma prolongada y con titulación elevada, incluso en pacientes con tratamiento adecuado y buena evolución clínica y existen falsos positivos al presentar reacciones cruzadas con Vibrio cholerae, Francisella turalensis y Yersinia enterocolítica 09.

Enzimo-inmunoensayo (ELISA). Cuantifica IgM, IgG e IgA con actividad anti-LPS de la Brucella y en algunos estudios muestra una sensibilidad superior a la seroaglutinación. Falta de Ag estándar: difícil generalizar los resultados, no se utiliza de forma generalizada y tampoco ofrecen la posibilidad de establecer un criterio para discernir entre curación y evolución a cronicidad. Brucellacapt. Nueva prueba de inmunocaptura-aglutinación para detectar Ac totales a Brucella. Varios trabajos de autores españoles han comprobado una especificidad similar a la prueba de Coombs, pero con una mayor sensibilidad, presentando los títulos de ambas pruebas una altísima correlación.

Reacción de Huddleson:  Es una reacción de aglutinación rápida en placa. Se enfrentan cantidades decrecientes del suero a investigar con cantidades constantes de antígeno y se observa la presencia o no de aglutinación.  Existe una escala de títulos, establecida por convención, que permite la expresión de resultados.  Antígeno: suspensión de B. abortus al 3-12% de gérmenes en fenol, con verde brillante y cristal violeta. Anticuerpos: IgM, IgG1, IgG2 e IgA. Título significativo: mayor de 1:50. En ocasiones se observa el fenómeno de prozona, donde puede estar ausente la aglutinación en los títulos más altos a causa de un exceso de anticuerpos.  Este hecho debe tenerse en cuenta para evitar falsos resultados negativos por esa causa.

INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS DIAGNÓSTICAS  Al usar los métodos serológicos tener en cuenta Rx cruzada, y el tipo de Ac que predomina en cada etapa.  En etapa aguda se generan IgM e IgA y descenderan hasta negativizarse antes de 6 meses. La IgG permanece detectable durante 2 ó 3 años.  Los títulos son elevados desde las primeras semanas de la infección.  La prueba 2-ME se correlaciona con la evolución clínica de infección.

 La diferencia de títulos de aglutinación con y sin 2-ME puede ser importante por presencia de IgM, que se inactivan con 2-ME.  La IgG permiten seguir el curso de la infección.  Al hacerse crónica comienzan a incrementarse IgG incompletos o no aglutinantes, que no son capaces de dar positivas las reacciones de aglutinación. Cuando la concentración de Ac no aglutinantes en el suero investigado alcanza valores relativos importantes, estas reacciones pueden arrojar resultados de bajo título y aún negativos.  Para lograr un dx inicial correcto se recomienda las pruebas que evidencien presencia de AC totales, completos como incompletos.

Pruebas diagnósticas recomendadas en los pacientes con sospecha de brucelosis  Hemograma, VSG y bioquímica básica  Hemocultivos (mantener al menos 30 días)  Pruebas serológicas: Rosa de Bengala, SAT, Test de Coombs.  Pruebas complementarias según la focalidad sospechada: Radiografía Sacroilíacas, RMN, TAC, ecocardiograma, ecografía testicular.

Tratamiento Ningún antibiótico, por sí solo, logra la erradicación intracelular del microorganismo, y por ello se utilizan en combinaciones diversas con efecto sinérgico o aditivo, administradas durante varias semanas para reducir en lo posible la aparición de recidivas. Cuando éstas se presentan, la bacteria mantiene una sensibilidad antibiótica idéntica a la del episodio inicial, por lo que puede tratarse nuevamente con una pauta antibiótica similar. Los objetivos del tratamiento son:  Acortar el periodo sintomático de la enfermedad  Evitar la aparición de complicaciones focales o secuelas  Disminuir las recidivas

Valoración de la eficacia La clave para valorar la eficacia de los tratamientos es el número de fallos terapéuticos y recidivas que presenta cada pauta terapéutica.  Las fallos terapéuticos se definen como la persistencia o agravamiento de los síntomas después de un periodo que oscila entre 2 y 6 semanas (la terminación habitual de muchas de las pautas ensayadas).  La recidiva en pacientes cumplidores, depende de la pauta de tratamiento empleada (tipo de antimicrobiano y duración), el tiempo de evolución de la enfermedad, la presencia de hemocultivo positivo y una temperatura elevada en el momento de la evaluación inicial. La recidiva se suele presentar en las primeras semanas o meses tras terminar el tratamiento (más del 80% en los 6 meses siguientes del final del tratamiento).

Embarazo Las Tetraciclinas deberían ser evitadas durante el embarazo y lactancia al interferir en el desarrollo dentario por excretarse por la leche. Además, las Tetraciclinas han sido asociadas con hepatotoxicidad grave y pancreatitis al administrarse a gestantes. La estreptomicina debe evitarse por su potencial efecto lesivo sobre el octavo par craneal fetal. Pauta A: rifampicina 900 mg (15 mg/ Kg/ día si peso menor de 50 Kg) una vez al día durante 45 días. Se considera el régimen de elección 6. 6 Pauta B: cotrimoxazol ( 8 mg TM/ 40 mg SX/ Kg/ día en dos dosis cada 12 horas) administrado junto con Rifampicina durante 4 semanas es un tratamiento alternativo. Recidivas Las recidivas no presentan resistencia a los antibióticos y casi todas responden a la misma pauta de tratamiento inicial. No obstante el uso de rifampicina, ciprofloxacino o estreptomicina en monoterapia se ha seguido de resistencias en algunos casos.

Prevención  Erradicación de la enfermedad en el ganado con la vacunación sistemática y la detección y eliminación de animales infectados.  Los guantes, mascarillas y batas son medidas de protección contra la exposición a sangre y secreciones de animales infectados.  En el laboratorio seguir precauciones en bioseguridad.  Debido al riesgo potencial de desarrollar brucelosis tras una exposición significativa, es prudente profilaxis postexposición.  Además, la pasteurización de la leche y otros productos lácteos, especialmente en zonas donde la brucelosis es frecuente en el ganado, es un medio importante para la prevención.

¡Muchas gracias!