Dispersión de luz (light scattering) Matías Möller Fisicoquímica Biológica

Dispersión de luz Por qué el cielo es azul? Cómo se ve el cielo de la luna?

Dispersión de luz John William Strutt Lord Rayleigh

Dispersión de luz El fotón incidente induce un dipolo oscilante en la nube electrónica. Al cambiar el dipolo, la energía se irradia-dispersa en todas direcciones.

Dispersión de luz por proteínas Intensidad de luz dispersada es proporcional a la masa molecular y concentración Sensible a la presencia de pequeñas cantidades de agregados Polidispersity (homogeneidad) control de calidad, cristalización de proteínas

Dispersión de luz por proteínas Se puede analizar de diferentes maneras: Intensidad promedio (Estática) (SLS, static light scattering) Fluctuaciones en la intensidad (Dinámica) (DLS, dynamic light scattering)

Dispersión de luz estática Medida de masas moleculares Intensidad promedio de dispersión es función de la masa molecular y el 2do coeficiente virial K = constante óptica MM = masa molecular A2 = 2do coeficiente virial C = Concentración (g/L) Rq = relación de Rayleigh (término que incluye la intensidad)

Dispersión de luz estática Constante Relación de Rayleigh Factor de forma, = 1 si r < 60 nm (para rm < l/10)

Dispersión de luz estática La intensidad de luz dispersada que produce una macromolécula es proporcional al producto de la masa molecular promedio y la concentración de la macromolécula (I α MM.C) Si no hay dependencia entre la intensidad de dispersión y el ángulo de medida, se puede determinar MM con medidas en un solo ángulo Un gráfico de Debye permite la determinación de: MM absoluta 2do coefciente virial (A2)

Dispersión de luz estática Gráficos de Debye: Preparar un número de concentraciones de la proteína en un buffer apropiado

Dispersión de luz estática Ecuación de Rayleigh Una gráfica de KC/Rq vs C debería dar una linea recta cuyo intercepto a cero concentración será 1/MW y el gradiente A2

Dispersión de luz estática

Dispersión de luz estática

Dispersión de luz estática 2do coeficiente virial Propiedad termodinámica que describe la fuerza de interacción entre la molécula y el solvente Si A2 > 0, las moléculas tienden a permanecer en solución (la proteína prefiere el buffer) Si A2 = 0 la fuerza de la interacción proteína-solvente es equivalente a la fuerza de la interacción proteína-proteína (el solvente se llama solvente theta) Si A2 < 0, la proteína tiende a precipitar o agregar

Dispersión de luz estática

Dispersión de luz estática Masa molecular de proteínas

Dispersión de luz estática Medidas En batch/cubeta En línea combinado con un paso de fraccionamiento, principalmente Cromatografía de exclusión molecular

Dispersión de luz estática La masa molecular medida en experimentos de dispersión son MM promediada por el peso (fracción en g) Para un sistema simple de dos componentes con proteína monomérica y agregados:

Dispersión de luz estática Para determinar MM individuales: Fraccionar la muestra Combinar medidas de dispersión con un paso de fraccionamiento  SEC / MALS

Dispersión de luz estática (índice de refracción)

Dispersión de luz estática

Dispersión de luz estática

Dispersión de luz estática (índice de refracción)

Dispersión de luz estática Señal de dispersión Rq α MM C Debido a alta MM, los agregados dispersan fuertemente Variación angular en la Intensidad de luz dispersada se relaciona con el tamaño de la molécula La luz dispersada por agregados muestra dependencia angular, mientras que la luz dispersa por monómeros y dímeros no.

Dispersión de luz estática (índice de refracción)

Dispersión de luz estática

Dispersión de luz estática

Dispersión de luz estática Figure 5. Determining Mw for protein complexes by SEC-MALLS. Data are shown for -haemoglobin (Hb), Hb-stabilizing protein (AHSP) and the Hb:AHSP complex (1.2:1 molar ratio). Calculations of Mw for 0.05 ml fractions across the elution peaks (black dots) were based on LS measurements at three angles (mini-DAWN with 690 nm laser, Wyatt Technology Corp., Santa Barbara CA) and concentrations from refractive index (Optilab differential refractometer, Wyatt). Numbers printed next to the main peaks are the average Mw values (kDa) for the whole peak. The value of Mw for Hb is significantly above the predicted value of 15.3 kDa, consistent with the presence of weak self-association (see Fig. 1). The Mw for AHSP is close to the predicted value of 12.0 kDa, indicating a monomer. The early elution time for AHSP is indicative of a nonspherical shape. The Mw of the Hb:AHSP complex corresponds closely to the predicted value for a heterodimer (27.2 kDa; the small free Hb peaks is consistent with the molar mixing ratio).

Dispersión de luz estática Pros Determinacion de MM rapida y exacta (promedio) de macromoleculas en solución Combinando SEC-MALS se puede determinar MM con una precision ± 5% Dependencia angular de señal de LS detecta agregados SEC-MALS permite detectar y cuantificar poblaciones de proteinas según sus MM Puede determinar estado oligomerico de polipeptidos modificados (prot-acidos nucleicos, glicosilados, etc. Contras Mide MM promedio, necesita separación para distinguir estados oligoméricos Posible perdida de muestra durante filtración y fraccionamiento

Dispersión de luz Dinámica

Dispersión de luz Dinámica DLS Permite determinar el tamaño de moléculas y nanopartículas Mide las fluctuaciones en la intensidad de dispersión con el tiempo para determinar el coeficiente de difusión translacional (D), y luego el radio hidrodinámico La velocidad de fluctuaciones depende del tamaño de la partícula - molécula

Dispersión de luz Dinámica Fluctuaciones son resultado del movimiento browniano y puede correlacionarse con el coeficiente de difusión y el tamaño

Dispersión de luz Dinámica La temperatura tiene que ser estable y exactamente determinada (regular la viscosidad y evitar la convección) Las partículas más grandes se mueven más lentamente A mayor temperatura, más rápido se mueven las moléculas La velocidad del movimiento Browniano está definido por el coeficiente de difusión translacional (D)

Dispersión de luz Dinámica Las fluctuaciones en la intensidad no son al azar, sino consecuencia del confinamiento de las partículas a sitios cercanos a la posición inicial en tiempos muy cortos

Dispersión de luz Dinámica Autocorrelación

Dispersión de luz Dinámica correlograma

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Dispersión de luz Dinámica Pros En cubeta, muy rápida detección de agregados y evaluación de la polidispersión de la muestra con un amplio rango dinámico Adecuado para estudiar cinética de agregación Detector disponible para placas, parara screening Contras Mide radio hidrodinámico, es cual es afectado por la forma de la partícula No puede distinguir entre cambios de forma o estado de oligomerización Necesita fraccionamiento para resolver oligómeros presentes en una mezcla

Bibliografía Protein sizing by light scattering, molecular weight and polydispersity, Malvern Instruments presentation, http://nanoparticles.org/pdf/nobbmann.pdf