CROMATOGRAFÍA α = [moléculas adsorbidas] Fase estacionaria: sólido o líquido fijado a un sólido Fase móvil: fluído (líquido o gas) que arrastra la muestra a través de la fase estacionaria Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de manera diferente con las dos fases estableciéndose un reparto entre ambas Se establece un equilibrio entre partículas adsorbidas y desorbidas α = [moléculas adsorbidas] [mol. adsorbidas] + [mol. desorbidas] coeficiente de reparto

FASE MÓVIL FASE ESTACIONARIA

Clasificaciones de cromatografía 1. Según como se encuentre la fase estacionaria a. columna b. batch c. plana cromatografía en papel y en capa fina

2. Según el tipo de fase estacionaria y fase móvil Sólida Líquida o gaseosa Líquido adsorbido Líquida o gaseosa

3. Según el tipo de flujo empleado a. Gravedad b. Capilaridad (papel, capa fina) c. Fluído a presión (HPLC)

HPLC (high performance liquid chromatography) Se basa en los mismos principios que la cromatografía a baja presión Tiene mejor resolución, tiempos menores, mejor reproducibilidad El material empacado en las columnas está formado por pequeñas partículas de tamaño muy uniforme y gran rigidez Permite trabajar con flujos altos para lo que se requiere aplicar presión Se requiere de columnas especiales construidas en acero inoxidable o vidrio grueso

FPLC (fast protein liquid chromatography) Es una variante del HPLC con columnas y equipamiento especialmente diseñado para separar o purificar proteínas Las columnas de FPLC soportan menos presión que las de HPLC

4. Según la finalidad del experimento Separación y purificación Preparativa Separación, cuantificación y caracterización Analítica

4. Según la interacción entre la fase móvil y el soluto a. Cromatografía de intercambio iónico carga-carga b. Cromatografía de interacción hidrofóbica efecto hidrofóbico c. Cromatografía de afinidad variada pero específica enlaces coordinación d. Cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) e. Cromatografía de fase normal y reversa dipolo-dipolo

Cromatografía de intercambio iónico La separación se basa en diferencias de carga a un pH dado Las interacciones son electrostáticas DEAE Dos tipos Q (DEPEA) Intercambio aniónico: matriz cargada positivamente (DEAE, TEA, QAE) Intercambio catiónico: matriz cargada negativamente (CarboxiMetilos (CM), Sulfonatos (S), fosfatos) Q (TMEA) CM S Elución: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza iónica o ambos

Cromatografía de intercambio iónico La carga neta de la proteína depende de su p.Isoeléctrico y el pH Interacción con: Intercambiador catiónico Intercambiador aniónico Elución: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza iónica o ambos

Cromatografía de intercambio iónico Amonio Quaternario

Cromatografía de intercambio iónico

Cromatografía de afinidad Se basa en una interacción biológica específica: Enzima-sustrato Anticuerpo-antígeno Enzima-coenzima Proteína-ligando específico La elución se puede lograr agregando el ligando (el que está unido a la columna) en solución o mediante cambios en el buffer que sean capaces de debilitar la interacción

Cromatografía de afinidad Interacción Biológica específica: Inmovilizado en Columna Glutatión Proteína A (o G) Streptavidina Quelante con Ni2+ Proteína Recombinante de fusión con GST Anticuerpo - IgG Conjugada con biotina Recombinante de fusión poliHistidina La elución se puede lograr agregando el ligando (el que está unido a la columna  GSH / Imidazol) en solución o mediante cambios en el buffer que sean capaces de debilitar la interacción (bajar el pH, etc.)

IMAC (immobilized metal affinity chromatography) Se basa en la formación de enlaces de coordinación entre iones metálicos inmovilizados y grupos básicos en proteínas (histidinas) Principalmente a los iones divalentes de metales de transición como Fe, Co, Ni, Cu y Zn La elución se lleva a cabo adicionando quelantes más fuertes como el imidazol a distintas concentraciones (hasta 500 mM) o cambios en el pH

Es muy utilizada para la purificación de proteínas recombinantes Generalmente se adicionan 6 histidinas en el extremo Nt o en el Ct Cola de (Histidina)6 Ni2+

Cromatografía de interacción hidrofóbica El soporte está sustituído con cadenas alifáticas de 2 a 10 carbonos (eter, c4-c8) u otros grupos hidrofóbicos (Fenilos) La interacción es de tipo hidrofóbica (guiada por entropia) La fase móvil debe tener una alta concentración de sales ((NH4)2SO3 2 – 4 M) Salting out Para la elución se disminuye la concentración de sales en la fase móvil

Cromatografía de interacción hidrofóbica

Cromatografía de interacción hidrofóbica

Cromatografía de fase reversa Está muy relacionada con la cromatografía de interacción hidrofóbica pero son diferentes El soporte está sustituído por alifáticas pero más largas (8 -18 carbonos/ C8-C18) y la densidad de sustituyentes es mayor La unión es más fuerte y por eso requiere mezclas con solventes no polares para la elución Desnaturaliza proteínas  Se usa mas para péptidos y algunas proteínas particularmente hidrofóbicas Se utiliza en HPLC

Cromatografía de fase reversa

Gel filtración (cromatografía de exclusión molecular / SEC) No es una cromatografía estrictamente porque no ocurre adsorción La separación se da por tamaño  radio hidrodinámico

El gel debe ser inerte, de tamaño de poro definido y sin carga Las proteínas mas pequeñas pueden entrar por difusión simple en las partículas en la fase estacionaria, por lo que son retenidas más tiempo y salen más tarde en una cromatografía.

Aplicaciones: Cambios de buffer / desalado  PD-10 (gravedad) / HiTrap (FPLC)

Aplicaciones: Determinación del peso molecular

Aplicaciones: Purificación de proteínas

Concluyendo…. La pregunta más importante… ¿En qué son distintas las sustancias que deseo separar?