Fasciola hepatica Causa la Fasciolosis Afecta rumiantes Zoonosis emergente, varios millones infectados en Bolivia y Perú Produce pérdidas multimillonarias a nivel global

Ciclo biológico de Fasciola hepatica

Problemas en el control de la Fasciolosis Drogas efectivas pero costosas Animales se reinfectan con facilidad Tratamiento no evita el daño hepático Focos de resistencia en Europa

Selección de los productos de excreción/ secreción (E/S) como objeto de estudio Se pueden obtener en forma relativamente sencilla en cantidades aceptables a partir de gusanos adultos La fasciola tiene intestino ciego por tanto regurgita el contenido. Sus componentes entran en contacto con el medio interno del huésped. Tienen composición menos compleja que el homogeneizado somático

ACTIVIDAD GELATINOLITICA DE LOS PRODUCTOS DE E/S DE FASCIOLA HEPATICA CL1 gelatinolytic activity CL2 29 kDa CL1 27,5 kDa CL2 gelatinolytic activity

Catepsinas L de Fasciola Son el 80% de los productos de E/S Producidas y secretadas por células del tubo digestivo CL1 de 27,5 kDa es mayoritaria CL2 de 29 kDa Se diferencian por actividad sobre péptidos fluorogenicos sintéticos

Actividades de CL1 y CL2 de Fasciola hepatica sobre peptidos fluorogénicos acoplados a AMC Kcat/Km M-1.s-1

Actividades in vitro de los PES de Fasciola hepatica sobre IgG1 humana Digestion of IgG1 by Fasciola hepatica E/S products and immunological characterization of the main released products. IgG1l (100 mg) was incubated for 22 h with F. hepatica E/S products(10 mg) at pH 7.3 and 37 C. Proteins were run on 12.5% SDS–PAGEunder nonreducing (left) and reducing conditions (right) and stained with CBB R-250 (lanes 1 through 4) or electrotransferred to nitrocelluelectrotransferred to identify the main digestion products by Western blotting using specific antisera (lanes a through h): Lanes 1 and 4, IgG1l undigested control; lanes 2 and 3, IgG1l 1 E/S products; lanes a and e, anti-L chain; lanes b and f, anti-Fd; lanes c and g, anti-Fcg, lanes d and h, anti-g1 H chain.

Actividades in vitro de las Catepsinas L de Fasciola hepatica sobre IgGs humanas Sitios de corte

Catepsinas L de Fasciola hepatica: Sitios de clivaje de IgGs humanas

Actividades de PES y Catepsinas L de Fasciola hepatica sobre inmunoglobulinas humanas de clase IgG Conclusiones CL1 y CL2 son las principales responsables de la degradación de las subclases de IgG con PES a pH 7.2 a manera de la papaína produciendo los fragmentos Fab y Fc A pH 5.5 los PES producen la degradación adicional a fragmentos pequeños derivados de la porción Fc Sólo IgG3 es clivada en ausencia de DTT Los sitios de corte determinados para CL1 y CL2 no se corresponden con los aa P1 y P2 de los sustratos sintéticos utilizados para determinar la actividad catepsina L (Phe-Arg )

Matriz extracelular y membranas basales

Actividad colagenolítica sobre colágeno fibrilar tipo I

Acividades sobre Fibronectina

Degradación de Laminina

Catepsinas L de Fasciola: Actividad proteolitica sobre componentes de la matriz extraceular y las membranas basales Conclusiones Colágeno I: es degradado por los PES y en menor medida por CL1 y CL2 en presencia de Cys. Colageno III: es clivado tanto por PES como por las CLs. Colágeno IV: degradado completamente por los PES sin Cys, y por CL1 y CL2 en presencia de Cys. Elastina: No se observa actividad proteolitica. Laminina: Es cortada por PES, CL1 y CL2. Fibronectina: Es atacada por PES, CL1 y CL2 produciendo patrones de corte diferentes.

Actividad fibrinogenolítica de CL2: Formación del coágulo

Inhibición de las Catepsinas L de Fasciola hepatica por anticuerpos de conejos infectados Conejos infectados con 30MT c/u y sangrados hasta s20 IgGs purificadas por afinidad Incubación IgGs con CLs, 20min, relación 10:1

Inhibición de las Catepsinas L de Fasciola hepatica por anticuerpos de conejos infectados y tratados La actividad gelatinolítica de ambas catepsinas desaparece a las 4-5 semanas postinfección y reaparece 2-4 semanas después del tratamiento con triclabendazol

ENSAYO DE VACUNACION Groups: CL1 CL2 Control Wk 0 4 6 20 Inmumization Booster Challenge Necropsy (100 ug antígen in CFA) (100 ug antígeno in IFA) (300 metacercariae)

ELISA ANALYSIS OF IgG RESPONSES AGAINST ELISA ANALYSIS OF IgG RESPONSES AGAINST CL1 AND CL2 IN SHEEP FROM TRIAL 1 CL2 CL1 A.U. A.U 300 600 250 500 200 400 150 300 100 200 50 100 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Semanas Semanas CONTROL CL1 CL2

Worm burdens and FEC in sheep vaccinated against F Worm burdens and FEC in sheep vaccinated against F. hepatica with CL1 and CL2 in Trial 1 Group Eggs/g Egg output reducción Flukes % worm Feces (%) recovered reduction CL1 41,8+/-41,2 71 109,1+/-24,6 34 CL2 28,0+/-38 81 107+/-40,1 33 Control 141,8+/-75,6 100 161,4+/-21,4 100

OTRAS PROTEASAS DE FASCIOLA HEPATICA DIPEPTIDIL PEPTIDASA (DPP) LEUCIN AMINOPEPTIDASA (LAP) CATEPSINA B LEGUMAINA

DIPEPTIDIL PEPTIDASA (DPP) Actividad presente en PES de adultos Clivaje preferncial de Gly-Pro y Lys-Ala Novel con relación a las DPPs de mamíferos Aún sin caracterización molecular

LAP de Fasciola hepatica Metaloproteasa Zn++ dependiente purificada de extracto soluble en deoxicolato Holoenzima hexamérica formada por subunidades de 67 kDa Asociada a tubo digestivo Purificada por columna de afinidad con su inhibidor Bestatina Trazas en los PES

TRIAL DESIGN Groups: CL1+CL2 LAP CL1+CL2+LAP Control Wk 0 4 6 20 Inmumization Booster Challenge Necropsy (100 ug antígen in CFA) (100 ug antígeno in IFA) (300 metacercariae)

WESTERN BLOT ANALYSIS OF IgG RESPONSE AGAINST F WESTERN BLOT ANALYSIS OF IgG RESPONSE AGAINST F. HEPATICA PROTEINASES IN SHEEP DURING THE COURSE OF VACCINATION TRIAL Groups: Weeks: Control CL1+CL2 LAP CL1+CL2+LAP LAP CL2 CL1 P L P L P L P L P L P L P L P L P L P L P L 0 12 0 6 12 0 6 12 0 6 12 P =E/S products L =Leucine aminopeptidase

IgG ANTI-LAP RESPONSE IN GROUPS OF SHEEP VACCINATED AGAINST FASCIOLOSIS IN TRIAL 2 7000 A.U. 6000 5000 CONTROL 4000 LAP CL1-CL2 3000 CL1-CL2-LAP 2000 1000 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Weeks

IgG ANTI-CL2 RESPONSE IN GROUPS OF SHEEP VACCINATED AGAINST FASCIOLOSIS IN TRIAL 2 50 100 150 200 250 300 350 400 450 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Weeks A.U. CONTROL LAP CL1-CL2 CL1-CL2-LAP

IgG ANTI-CL2 RESPONSE IN GROUPS OF SHEEP VACCINATED AGAINST FASCIOLOSIS IN TRIAL 2 A.U. 100 200 300 400 500 600 700 800 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Weeks CONTROL LAP CL1-CL2 CL1-CL2-LAP

Worm burdens recovered in sheep vaccinated against F Worm burdens recovered in sheep vaccinated against F. hepatica with CL1, CL2 and LAP in Trial 2 GROUP: CL1-CL2 GROUP: CONTROL Animal No. Flukes recovered Animal No. Flukes recovered 104 56 101 126 110 89 119 59 114 0 122 54 121 0 134 56 125 5 139 65 128 1 Mean 72 135 0 136 0 137 57 Mean 23,1

Worm burdens recovered in sheep vaccinated against F Worm burdens recovered in sheep vaccinated against F. hepatica with CL1, CL2 and LAP in Trial 2 GROUP: LAP GROUP: CL1-CL2-LAP Animal No Flukes recovered Animal No Flukes recovered 106 0 102 43 107 1 116 0 113 38 120 0 123 0 124 0 130 0 127 30 132 0 138 0 Mean 6,5 Mean 12,1

Reduction in F. hepatica worm burdens obtained in Trial 2 with CL1, CL2 and LAP Group Reduction (%) LAP 89,6 CL1-CL2 60,1 CL1-CL2-LAP 79,3

OVERVIEW OF VACCINATION TRIALS CONDUCTED IN SHEEP Antigen Protection Egg Output Reduction ProCL1r Not Significant ND CL1 32% 71% CL2 34% 81% Paramyosin 57% 85% CL1-CL2 60% 82% CL1-CL2-LAP 79% LAP 90% 91%

Ensayos in vitro muestran una correlación positiva entre la capacidad de inhibición de la actividad enzimática por parte de los anticuerpos LAP específicos y los niveles de protección alcanzados

Construcción del producto LAP completo 5´RACE 3´RACE M 3´ 5´ 5 Ciclos Generación de FL 2Kb 1,3 kb PCR 20 Ciclos Amplificación de FL

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GGGGGGGAATTGGCAATGGCGGCGTTGGCTGTGGGCGTGTCTGATCTGTCGGATAAGCGGTTCGACGTTGTTATATTCATCAACGATGATGCCGACGAGGGATGCGCGAAGGATGCGGCCGTGTATGAAGCCTTGAAATCATTCTCCAAA M A A L A V G V S D L S D K R F D V V I F I N D D A D E G C A K D A A V Y E A L K S F S K   160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ATCAATCCTAATTTAGGTAGTGAACTGTCAATTGTTCCGTTTCCTGCCCATCCATCTGGACGACTGATCTACAGTCCAACAGGAGCATTGAACACGGACACGGCGGATATACGCAACGTGTATGATGCTGCTTGCGCTGGAGTCAAACGT I N P N L G S E L S I V P F P A H P S G R L I Y S P T G A L N T D T A D I R N V Y D A A C A G V K R 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 GCCCTGTCAATGGGGTGTCATGCTCCTCTGCTCTATCTGGGCTCACTTCGTTCCGCCTCTTTTGGATTTGAGTGGATGCAACGCAAACATCTGCTACTCAATGCTCTGCTTGGCGCGTACCATGCACTCTATCTGCCACTGGAAGTACGT A L S M G C H A P L L Y L G S L R S A S F G F E W M Q R K H L L L N A L L G A Y H A L Y L P L E V R 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 GAGATGAGACCCACAACAGGACTAAAAGCCCAACATTTGGGTGTGAAAGAGGACACAAAAGGGTCGGACGAGTTGGTTCTACGCTTGGCTATGGCTCTTGAGGAAGGTCGCTGGCTTGCACGAGATATCGGTGGTTCCGATCCGGAACGA E M R P T T G L K A Q H L G V K E D T K G S D E L V L R L A M A L E E G R W L A R D I G G S D P E R 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 730 740 750 ATGGCTGCACCCAGAATTGTGGACTATCTGAAAACTTCACTCGGTGGTATGAAGGGAATTACCATGAGTGTGGAAAAGGTGGACATTCAGAAATACCCTCTGATGGCTGCGGTGAATCGTGCGGCATCCGTTGTCGCACGCCATGACGGA M A A P R I V D Y L K T S L G G M K G I T M S V E K V D I Q K Y P L M A A V N R A A S V V A R H D G 760 770 780 790 800 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 CGCGTGGTTCATCTCAAGTACGAGCCGCCCAATCCAACCGAGGTGGATACGACTCTTTACTTGATTGGAAAAGGTATCACTTATGACACCGGTGGAGCAGACATCAAGGCGAACGGAGTGATGGCTGGAATGCATCGGGACAAGTGTGGT R V V H L K Y E P P N P T E V D T T L Y L I G K G I T Y D T G G A D I K A N G V M A G M H R D K C G 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 GCGGCTGCGATTGCTGGTTTGTTCAAAACTCTGGGTGAACTTCAACCTCCGGGACTGTCAGTGTCCGCCGCGCTGGCTTTCGTGCGCAACAGTGTTGGTGCAGATTCGTATGTGGCCGATGAGATTCTGGTAGCTCGTTCCGGCCAACGT A A A I A G L F K T L G E L Q P P G L S V S A A L A F V R N S V G A D S Y V A D E I L V A R S G Q R 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ATTCGCGTAGGAAACACGGATGCCGAGGGTCGCATGGTGATGACTGATCTGTTGTGCGAAGCAAAAGAGAAGGCAATCAATGCAACAAATCCGTTCCTCTTCACAATTGCTACTCTTACCGGCCATGTGGTACGGGCGTATAAACACTAT I R V G N T D A E G R M V M T D L L C E A K E K A I N A T N P F L F T I A T L T G H V V R A Y K H Y 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 1340 1350 ACGGCGGTCATGGACAATGGACCACCGCGTATACACCGTGTGTCTCAAAGTCTGCAAGAAGCTGGCGATCGTATTTCGGATATGGCTGAAATTTCAACTGTGCGTAAAGAAGACTACGAATTCAACCGAGGTAAAACGGAGTACGAGGAT T A V M D N G P P R I H R V S Q S L Q E A G D R I S D M A E I S T V R K E D Y E F N R G K T E Y E D 1360 1370 1380 1390 1400 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500 ACTCTTCAGTGCAACAATCTTCCCAGCAGTGCCACTCCTCGGGGTCATCAAATTCCGGCGGCATTCATGGCATTGGCTAGTGGATTGGACAAGCACGGATTGGGCTCTGCCAAACCAATTCCATACACGCATGTGGATGTGGCTGGCAGT T L Q C N N L P S S A T P R G H Q I P A A F M A L A S G L D K H G L G S A K P I P Y T H V D V A G S 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610 1620 1630 1640 1650 GCAACAGAAATTCACGTGTTGCCCACTGCCGCCCCTCTGTTGATGTTCGCCAGCCGTTACGTACTACCACGACTGGGATTCAAATAGGGCACCCGACACGTGTCACGTGCAGTCGATTCGTGGATATTTCCAACATTTCATTTGGATACG A T E I H V L P T A A P L L M F A S R Y V L P R L G F K * 1660 1670 1680 1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800 AATTTGTTTTGTCAATATTCGGTGGGATCAAACCATTGCGGATACTTTTTTTTACAATGTCTTCCATACCGGTTTGATTAATGGGACCCTTTCCCACCAAAACCCCCCAAAAAAAACTCTGTCATGCCGTTACGTAGCGTATCGTTGACA ... GCA

FhLAPr Expresión en E.coli pThioHis C M SI I Inducción IPTG 1mM 2hs 37°C Lisados celulares totales

Purificación 500 ml de cultivo Columna quelante Hi Trap (Ni) Binding: 50 mM Tris 01 M NaCl pH 8.3 Elución: 50 mM Imidazol 1 Muestra 2 No retenido 3 Control 4, 5, 6 Eluidos 7 s/ inducir 8 inducido

MODELADO MOLECULAR DE FhLAP

Catabolismo de la hemoglobina GLOBULOS ROJOS HEMOLISIS saposina Hb esófago ENDOPEPTIDASAS ej: catepsina L1 catepsina B catepsina D POLIPEPTIDOS gastrodermis lúmen del ciego   LEGUMAINA EXOPROTEASAS ej: catepsina C, dipeptidilpeptidasa Aminopeptidasa?   DIPÉPTIDOS gastrodermis lúmen del ciego

Reactividad cruzada entre FhLAPn y FhLAPr Inmunoblot Suero de oveja inmunizada con FhLAPn Suero de conejo inmunizado con FhLAPr SDS PAGE 12,5% condiciones reducidas

Maldi-Tof de FhLAPn 14 péptidos 192 residuos reconocidos en 523 36,7% de cobertura >FheLAPr MAALAVGVSDLSDKRFDVVIFINDDADEGCAKDAAVYEALKSFSKINPNLGSELSIVPFPAHPSGRLIYSPTGALNTDTADIRNVYDAACAGVKRALSMGCHAPLLYLGSLRSASFGFEWMQRKHLLLNALLGAYHALYLPLEVREMRPTTGLKAQHLGVKEDTKGSDELVLRLAMALEEGRWLARDIGGSDPERMAAPRIVDYLKTSLGGMKGITMSVEKVDIQKYPLMAAVNRAASVVARHDGRVVHLKYEPPNPTEVDTTLYLIGKGITYDTGGADIKANGVMAGMHRDKCGAAAIAGLFKTLGELQPPGLSVSAALAFVRNSVGADSYVADEILVARSGQRIRVGNTDAEGRMVMTDLLCEAKEKAINATNPFLFTIATLTGHVVRAYKHYTAVMDNGPPRIHRVSQSLQEAGDRISDMAEISTVRKEDYEFNRGKTEYEDTLQCNNLPSSATPRGHQIPAAFMALASGLDKHGLGSAKPIPYTHVDVAGSATEIHVLPTAAPLLMFASRYVLPRLGFK

Actividad frente a distintos aminoácidos nmol/min.mg Sustrato FhLAPr FhLAPn Leu-AMC 214.5 ± 5.5 134.4± 0.5 Arg-AMC 29.1 ± 0.8 75.2 ± 0.0 Ala-AMC 7.5 ± 0.1 8.32 ± 0.0 Phe-AMC 6.8 ± 0.2 14.08 ± 0.0 Tyr-AMC 6.4 ± 0.5 5.44 ± 0.0 Pro-AMC 5.6 ± 0.1 3.2 ± 0.2 Ser-AMC 2.1 ± 0.1 1.92 ± 0.0 Gly-AMC 1.9 ± 0.1 0.544 ± 0.0 Glu-AMC 0.12 ± 0.1 0.224 ± 0.0

Determinación de parámetros cinéticos Km (µM) Vmax (µM AMC/min) Kcat (min-1) Kcat/ Km (µM –1min-1) Leu-AMC 222 0.044051 0.0083 3.7 x10-5 Phe-AMC 484 nd Arg-AMC 881 Leu-AMC Phe-AMC Km Leu-AMC FhLAPn 204 µM FhLAPr 222 µM

Respuesta humoral de ovinos (ELISA) 0 4 6 10 15 20 25 4 Priming Recuerdo Desafio

Recuperación de parásitos en ensayo de inmunización en conejos Grupo N° de parásitos recuperados Promedio ± DS Parásitos/animal Grupo FhLAPr (n=6) 2 ± 1.67 4; 0; 3; 3; 2; 0 Control (n=6) 9 ± 1.78 10; 12; 8; 8; 7; 9 Recuperación Grupo Control = 18% Grupo Inmunizado = 4% Porcentaje de Protección (Control – Inmunizado) x 100 Control 78%