PRODUCCIÓN DE AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO M. Pía Cerdeiras CATEDRA DE MICROBIOLOGÍA FACULTAD DE QUIMICA

Requisitos para el desarrollo de un ACB Selección de un agente superior. Producción abundante y a un costo adecuado de propágulos. Formulación adecuada. Vida útil del producto final adecuada, preferiblemente sin refrigeración. Eficacia alta y estable en condiciones de uso a través de un sistema de aplicación adecuado. Registro/aprobación. Patente

Producción

Producción de ACBs Fermentación sumergida (sustrato líquido) (FSL) Fermentación sobre sustrato sólido (FSS).

Crecimiento Crecimiento implica un aumento ordenado de todos los componentes de un organismo y no solamente de alguno de ellos. En organismos unicelulares el crecimiento conduce a un aumento en el número de células más que un aumento en el tamaño celular

Crecimiento de un microorganismo en medio de cultivo líquido

Crecimiento en cultivo en lote (batch) Luego de la adición de m.o. al medio líquido fresco se observa la siguiente cinética de crecimiento Fase lag - las células se adaptan al nuevo ambiente, aun no se dividen Fase exponencial (log) - velocidad máxima de crecimiento bajo condiciones particulares, tiempo de generación mínimo Fase estacionaria - sin crecimiento neto, vc=0 ó estadísticamente = 0 cuando: vc=vm (vel. crecimiento es igual a la de muerte) nutrientes limitantes, pero suficientes para mantener actividad acumulación de desechos, inhibición del crecimiento Fase de muerte - velocidad de muerte celular > velocidad de división celular

Fermentación sobre sustrato sólido Existe falta de conocimiento en cuanto a patrones y cinética de crecimiento en FSS La disposición 3-D del micelio y del sustrato. La heterogeneidad del sustrato en sí. La dificultad de obtener medidas directas de la biomasa microbiana formada.

Evaluación del crecimiento 1- Determinación del número de microorganismos Métodos directos: recuento total Métodos indirectos: recuento de viables

2- Determinación de la masa celular Métodos directos Medida de la masa Medida del volumen Métodos indirectos Determinación del contenido de N, C, P, etc Turbidimetría 3- Determinación de la actividad celular Actividad enzimática Concentración de un metabolito Medida de la respiración

Diferencias entre FSS y FSL Algunos hongos filamentosos no pueden ser crecidos en FSL. Algunos hongos sólo esporulan en FSS. Los sistemas de fermentación a nivel industrial están más desarrollados para la FSL. Los sistemas de FSL son más fáciles de controlar (temp., pH., etc.).

El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB Medio de cultivo Relación C/N Actividad de agua Sistema de cultivo (FSL oFSS) Momento de la cosecha Temperatura, pH, aereación, agitación, etc

El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB Medio de cultivo Relación C/N Actividad de agua Sistema de cultivo (FSL oFSS) Momento de la cosecha Temperatura, pH, aereación, agitación, etc

Influencia del medio de cultivo sobre la eficiencia de las ascosporas de Talaromyces flavus contra marchitamiento a Verticilium Spores produced per petri dish 2 x 1010 4 x 1010 8 x 109

El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB Medio de cultivo Relación C/N Actividad de agua Sistema de cultivo (FSL oFSS) Momento de la cosecha Temperatura, pH, aereación, agitación, etc

Relación C/N del medio de cultivo afecta la morfología de los conidios de Colletotrichum truncatum 10:1 30:1 80:1

Relación C/N del medio de cultivo afecta la calidad de los conidios de Colletotrichum truncatum Parámetro de calidad Relación C/N 1:10 1:30 1:80 Producción de conidios + ++ Velocidad de germinación rápida lenta Formación de apresorios Alto bajo Contenido de proteínas alto Bajo

El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB Medio de cultivo Relación C/N Actividad de agua Sistema de cultivo (FSL oFSS) Momento de la cosecha Temperatura, pH, aereación, agitación, etc

Efecto del potencial de agua (WP) sobre la cantidad y calidad de conidios de Trichoderma harzianum Medio WP Biomasa Log conidia Germinación Mpa g/l por g (%) RM8+0% glicerol -0.8 358 A 10.72 A 4.0 A RM8+3% glicerol -2.0 492 D 10.75 A 15.3 B RM8+6% glicerol -2.8 447 C 10.86 B 35.9 C RM8+9% glicerol -3.7 444 C 11.04 C 67.3 D RM8+12% glicerol -4.8 400 B 10.76 A 37.0 D

El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB Medio de cultivo Relación C/N Actividad de agua Sistema de cultivo (FSL oFSS) Momento de la cosecha Temperatura, pH, aereación, agitación, etc

Influencia del sistema de cultivo sobre la producción de conidios de Trichoderma harzianum Parámetro Sólido Líquido Producción (log esporas/ml) 10.0 8.0 Tiempo de incubación (h) 76.0 48.0 Productividad (log esporas/ml/h) 8.1 6.3

Propiedades de esporas de Trichoderma harzianum producidas por FSS y FSL

El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB Medio de cultivo Relación C/N Actividad de agua Sistema de cultivo (FSL oFSS) Momento de la cosecha Temperatura, pH, aereación, agitación, etc

Crecimiento de un microorganismo en medio de cultivo líquido

Efecto del momento de la cosecha sobre la viabilidad de clamidosporas de Gliocladium virens 88 98 1.25 x 108 160 82 1.2 x 108 135 73 86 120 62 78 1.0 x 108 113 29 59 6.1 x 107 91 17 41 5.2 x 107 87 12 19 2.5 x 106 64 43 Viabilidad luego de 300 días Productividad UFC ml –1 Cosecha (h) Eyal et al., 1997

El método de producción puede afectar la morfología, cantidad y calidad de los elemento de propagación Grosor de la pared de los conidios Tipo y tamaño de los conidios Velocidad de germinación Hidrofobicidad Vida útil Productividad Resistencia al UV Eficiencia como biocontrolador

Formulación

Formulación La mezcla de ingredientes y la forma de preparar un principio activo para su empaque, almacenamiento y expedición al lugar de uso.

Cuatro funciones básicas de la formulación: Estabilizar el principio activo. Ayudar en su manejo y aplicación. Protegerlo de factores ambientales adversos en el sitio de acción, y por lo tanto aumentar su persistencia. Aumentar su actividad en el sitio de acción, ya sea por aumento real de la actividad, y/o por aumento de la reproducción, contacto o interacción con el patógeno diana.

Problemas hallados durante la formulación de ACBs. Cosecha Estabilización Almacenamiento Aplicación Post-aplicación Reduction of material bulk Division into appropiate particle size Prevent growth of BCA and contaminant microorganisms Prevent proteases denaturing active agent Avoid powders caking due to moisture uptake Control viscosity of liquids to keep particles in suspension Retain viability (good shelf-life) Ensure good performance in applicators for dusts/powders/granules Maintain appropiate viscosity of liquids to form spray droplets Ensure good performance of sprayers without making foam Ensure good coverage and retension Reduce physical loss by rain or other means Protect against inactivation by environmental factors

Tipos de formulaciones Productos secos Polvos, gránulos Perlas de alginato, capsulas Polvos mojables Productos líquidos Suspensiones acuosas u oleosas Emulsiones w/o o o/w

Aditivos (excipientes) Carriers Binders Adherentes Surfactantes Emulsificantes Humectantes Desecantes Protectores solares

Carriers: Inert ingredient to hold or dilute organisms to desired concentration and improve coverage and distribution. Plant material: e.g. flour, bran, peat, wheat Mineral carriers: e.g. bentonite clay minirals, diatomic earth, talc, vermiculite Liquid carriers: e.g. skimmed milk, rape oil, chainsaw oil, Carriers are inert in the sense that they do not have pest or disease control capabilities

Supervivencia de Pseudomonas fluorescens en diferentes carrier a 25°C Número de P. flourescens (10x UFC/g) a distintos días de almacenamiento Carrier 0 30 60 Turba 6.6 a 5.2 a 4.4 a Talco 6.8 a 3.7 c 2.9 b Lignita 6.4 a 4.9 b 2.7 b (Rabidran & Vidhyasekaran, 1996)

Número de conidias y clamidosporas de Trichoderma en tierra

Dissicant Water absorber that dries a product at harvest and during storage E.g silica gel Silica powder Calcium chloride

Supervivencia de IK726 con y sin agregado de desecante

Effect of drying conidia of Metarhizium flavoviride when stored with and without silica gel (dissicant) Survival (%) Conidia moisture no silica with silica weeks Temperature (%) C Undried 44.8 59 - 11 10-14 Pre-dried 4.3 93 - 11 10-14 Pre-dried 5.0 95 97 18 10-12 Undried 44.0 0 51 14 28-32 Pre-dried 7.5 23 76 14 28-32 Pre-dried 5.0 9 42 14 28-32

Germinination of dried IK726 conidia on water agar Germinination of dried IK726 conidia on water agar. Conidia were stored at 4°C and 20 °C

Binders 1: Liquid fixing organisms and additives to carrier or seed Binders 1: Liquid fixing organisms and additives to carrier or seed. 2: Holds formulated products together into aggregates E.g. gum arabic, gum guar, alginate, carboxymethyl-cellulose, starch, sucrose, honey Emulsifiers used with oils

Surfactants Sunscreens Surfactants/wetter/spreader: used with water. Improves mixing of product with liquid. Reduces surface tension. Improves spread of a spray on a plant surface. E.g. Tween, Triton-X, Teepol, Silwet Sunscreens additives to prevent/alleviate damage due to sunlight (UVB, 280-320 nm and UVA, 320-400 nm) e.g. reflectors like zinc oxide, talcum, silicate and UV- blockers like caly, starch, carbon

Effect of formulation additives on a target surface surfactant

Formulación óptima se relaciona con: El ACB en particular Método de producción Excipientes