EXPRESIÓN DE GENES RELACIONADOS CON LA PROLIFERACIÓN Y GENES MEDIADORES DE MUERTE CELULAR EN SMC. Perales, S; Linares, A; Palomino, R; Alejandre, M.J Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada INTRODUCCIÓN Nuestro interés se ha centrado en la expresión de genes que codifican proteínas implicadas en el proceso apoptótico y de proliferación como son: bcl-2, bcl-X L, c-myc y p53 en células de músculo liso (SMC) expuestas a factores aterogénicos como son una dieta de colesterol (experimentos in vivo) (1), o a oxiesteroles y óxido nítrico (experimentos in vitro). Por otra parte, hemos estudiado la expresión de los distintos genes al cambiar la dieta de colesterol por dieta de aceite de pescado conocido por sus propiedades antiaterogénicas. Teniendo en cuenta que c-myc y p53 son oncogenes implicados tanto en la proliferación como en la apoptosis, podrían tener un papel clave en el desarrollo de patologías relacionadas con las SMC. En este sentido se ha visto que existe una desregulación de c-myc en SMC procedentes de placas ateroscleróticas y que éstas aumentan su susceptibilidad a la apoptosis mediada por p53 (2,3). Respecto a bcl-2 y bcl-X L son genes antiapoptóticos de la familia bcl-2, con capacidad para dimerizar entre si y con miembros proapoptóticos. De esta manera la proporción de genes apoptóticos /antiapoptóticos expresados determinará la supervivencia/muerte de la célula. Estos genes tienen una gran importancia si entendemos que, el incremento en la proliferación sin incrementar la apoptosis es el mecanismo para desarrollar la patogenia aterosclerótica en animales hipercolesterolémicos (4). METODOLOGÍA Animales y dietas Se utilizaron pollos (Gallus domesticus) de la raza White Leghorn. Se alimentaron desde su nacimiento hasta los 20 días con tres tipos de dietas: Grupo-C con dieta normal, el grupo-Ch con una dieta de colesterol al 5%, y el grupo-A con la dieta rica en colesterol durante 10 días y 10 días más con una dieta en aceite de pescado al 10%. Cultivo de células El cultivo primario de SMC se obtuvo a partir del arco aórtico de los pollos. Las células se obtuvieron mediante el método descrito por Chamley-Campbell et al. modificado en nuestro laboratorio (1) Tratamientos in vitro Las células se incubaron con 25-hidroxicolesterol a una concentración de 20 µg/ml durante 24h y con Nitroprusiato sódico como donador de óxido nítrico que se usó a 0.6 mM durante 8h. Cuantificación del mRNA. Se aisló el RNA total con TRIZOL (Invitrogen) y se retrotranscribió a cDNA mediante una retrotrascriptasa (PowerScript Reverse Trascriptase de Clontech). La mezcla de reacción se preparó de acuerdo con el fabricante del sistema Fast Start DNA Master SYBR Green I (Roche). Para la cuantificación se utilizó un LightCycler real-time PCR con un método de cuantificación relativa a un gen constitutivo ( -actina) y utilizando el método de análisis matemático descrito por Michael W.Pfaffl (5) que no requiere curvas de calibrado dado que se incluyen niveles de control para estandarizar cada reacción. Los cebadores para cada cDNA fueron diseñados específicamente para las secuencias de pollo. Se calcularon las eficiencias (E), el rango de linealidad para cada cDNA y se realizó la cuantificación relativa del nivel de expresión según la proporción siguiente: RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se han estudiado los cambios de expresión a nivel de los mRNA de genes implicados en el proceso apoptótico como son bcl-2, bcl-X L, c-myc y p53, en tres tipos de cultivo de SMC (C, Ch y A) La expresión de los genes se ha medido a nivel basal, tras la adición de 25-hidroxicolesterol (20 g/ml) durante 24h y tras la incubación con nitroprusiato sódico como dador de óxido nítrico (0.6 mM) durante 8h. bcl-2 Análisis de la expresión de bcl-2 en SMC-C, SMC-Ch y SMC-A a nivel basal, tras la adición de 25-Hidroxicolesterol y Nitroprusiato. A nivel basal (experimentos in vivo) la expresión de bcl-2 se muestra ligeramente disminuida para las SMC-Ch, mientras que en SMC-A esta aumentada. La adición de 25-hidroxicolesterol (experimentos in vitro) provoca un aumento del mRNA de bcl-2, especialmente en las SMC-Ch. Estos resultados pueden parecer contradictorios con lo que se conoce a nivel de proteína Bcl-2, la cual disminuye al tratar las células con oxiesteroles, sin embargo esto ocurre principalmente porque la proteína esta dimerizando con Bax la cual aumenta en presencia de oxiesteroles tal y como hemos visto en nuestro laboratorio (6). La acción del nitroprusiato como donador de óxido nítrico provoca una disminución en los niveles de expresión de bcl-2, por el contrario para las SMC-C, se produce un ligero aumento. En estudios con SMC tratadas con NO se ha observado que las SMC de fenotipo sintético tienen disminuidos los niveles de Bcl-2 respecto a las SMC contráctiles, lo que indica una susceptibilidad a la apoptosis de las SMC sintéticas (7). Esto estaría de acuerdo con nuestro resultado para las SMC-Ch. Análisis de la expresión de c-myc en SMC-C, SMC-Ch y SMC-A a nivel basal, tras la adición de 25-Hidroxicolesterol y Nitroprusiato. A nivel basal (experimentos in vivo) no se aprecian grandes diferencias, aunque en SMC-A se aprecia una cierta elevación. Al tratar los cultivos con 25-hidroxicolesterol se provoca un gran incremento en la expresión de c-myc especialmente para SMC-Ch. Este aumento se produce también tras la adición de óxido nítrico, especialmente para las SMC-C. Tanto para el oxiesterol como para el NO se pone de manifiesto que una alta expresión de c-myc induce una continua proliferación, reducción de alpha-actina y apoptosis en SMC, compatibles con los cambios que las SMC sufren de pasar de fenotipo contráctil a sintético (2). El hecho de que los niveles de c-myc en SMC-A sean inferiores de nuevo nos mostraría una cierta protección de las SMC-A al desarrollo de la patología. Análisis de la expresión de bcl-X L en SMC-C, SMC-Ch y SMC-A a nivel basal, tras la adición de 25-Hidroxicolesterol y Nitroprusiato. A nivel basal (experimentos in vivo) no se aprecian grandes diferencias aunque de nuevo encontramos que para las SMC-Ch la expresión de bcl-X L está ligeramente disminuida. Está descrito que la inhibición del NF-kβ (activador de genes de supervivencia celular) da lugar a una disminución de la expresión de bcl-X L y que esto sensibiliza a las células para la apoptosis (8). Al adicionar 25-hidroxicolesterol aumenta notablemente el mRNA de bcl-X L en los tres tipos de cultivo. Al igual que ocurre con la proteína Bcl-2, que dimeriza con Bax (muy aumentada) y otros miembros proapoptóticos por lo cual al analizar el nivel de proteína aparece disminuida (6). La acción de óxido nítrico provoca una disminución en los niveles de bcl-X L especialmente para las SMC- Ch. Lo cual nos muestra una mayor predisposición a la apoptosis. Como hemos señalado en los niveles basales hay que tener en cuenta que el NO inhibe al NF-kβ Análisis de la expresión de p53 en SMC-C, SMC-Ch y SMC-A a nivel basal, tras la adición de 25-Hidroxicolesterol y Nitroprusiato. A nivel basal (experimentos in vivo) hay que destacar que p53 se encuentra elevado para las SMC-A. Recientemente se ha presentado la idea de que los niveles endógenos de p53 protegen a las SMC de la apoptosis y reducen el desarrollo de la aterosclerosis (9). Este podría ser el caso de las SMC-A. Al incubar las células con 25-hidroxicolesterol se observa un gran aumento del mRNA en los tres tipos de cultivo. Esto concuerda con el hecho de que los niveles para la proteína Bax también aumentan mucho mediado posiblemente por p53. Sin embargo el óxido nítrico provoca una elevación discreta en los niveles de expresión de p53, especialmente para las SMC-Ch en las cuales casi no varía respecto al nivel basal. En este caso de nuevo nos encontramos una situación diferencial en la acción del óxido nítrico. Atendiendo a lo expuesto para los niveles basales podría indicar una predisposición a la apoptosis y al desarrollo de la aterosclerosis de las SMC-Ch. CONCLUSIÓN : Estos resultados nos permiten concluir que, existe un desequilibrio en los procesos de proliferación / muerte celular compatibles con los estados iniciales del proceso aterosclerótico. Sin embargo las SMC-A muestran una expresión intermedia, indicativo de que el proceso es aún reversible. BIBLIOGRAFÍA 1.- Carazo A, Alejandre MJ, Díaz R, Rios A, Castillo M, Linares A. Changes in cultured arterial smooth muscle cells isolated from chicks upon cholesterol feeding. Lipids. 1998, 33: Bennet MR et al. Deregulated expression of the c-myc oncogene abolishes inhibition of proliferation of rat VSMC, and induce apoptosis. Circ Res 1994; 74(3): Motokumi A. et al. Inhibition of the p53 suppresor gene results in growth of human ASMC. Hypertesion. 1995; 34: McCarty N.J, Bennett M.R. The regulation of vascular smooth muscle cells apoptosis. Cardiovascular Research 2000, 45: Michael W Pfaffl. A new mathematical model for relative quantification in real-time PCR. Nucleic Acids Reseache, 2001, vol29, No Perales S, Linares A, Palomino R, Alejandre MJ. Expresión de genes relacionados con la proliferación y genes mediadores de muerte celular en SMC..XXVII Congreso de la SEBBM P Herbert K.F. Lau. citotoxicity of nitric oxide donors in smooth muscle cells is dependent on phenotype, and mainly due to apoptosis. Atherosclerosis 2003, 166: Huerta-Yepez S, et al. Nitric oxide sensitizes prostate carcinoma cell lines to TRAIL-mediated apoptosis via inactivation of NF-kappa B and inhibition of Bcl-X L expression.Oncogene Jun 24; 23(29): Mercer J, Bennet MR. Endogenos p53 protects VSMC apoptosis and reduced atherosclerosis in Apo-E knockout mice. Cardiovascular Pathology 13 (2004) S17-S79