CITOQUIMICA “APLICADA A LA HEMATOLOGIA” Bqca. Ivan María Victoria Hematología Clínica 2011

MORFOLOGÍA <----->BIOQUÍMICA La citoquímica estudia la composición química de la célula y permite detectar la localización topográfica de algunos principios inmediatos, enzimas, metales pesados y otras sustancias. MORFOLOGÍA <----->BIOQUÍMICA Son un complemento de las tinciones hematológicas. Por medio de ellas se localizan enzimas y sustancias inorgánicas. Así se mejora la diferenciación celular. También sirven para el diagnóstico de ciertas leucemias.

CONFIABILIDAD DE LOS METODOS PARA EL Dx DE LAS LEUCEMIAS AGUDAS 70-80% CITOMORFOLOGIA. CITOQUIMICA. 90-95% INMUNOFENOTIPO MAS 99-100% MICROSC. ELECTRN. CITOGENETICA Y BIOL. MOLECULAR

Tres pasos fundamentales: Fijación: preservar las estructuras y reactividad funcional de las células. Incubación en el medio de reacción: como consecuencia se generan productos que ponen en evidencia el componente a ser estudiado. Contraste: permite detectar con mayor facilidad el producto de reacción . Las reacciones deben tener 3 características: sensibilidad, especificidad y reproductibilidad.

MUESTRAS UTILIZADAS EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFÉRICA PUNCION DE MÉDULA ÓSEA PUNCION DE GANGLIOS LCR

TIPOS DE TINCIONES Se pueden clasificar en: Atendiendo al nivel de vitalidad de las células que se pretende colorear, se pueden dividir en vitales y no vitales. Atendiendo al momento en el que empezaron a ser utilizadas para el Dx hematológico, se dividen en tradicionales y especiales.

TINCIONES VITALES Y NO VITALES Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre células que están vivas. Las tinciones vitales son aquellas que se efectúan sobre células que están vivas, mediante la introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo. Son colorantes vitales: el verde Jano y el azul de metileno. Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero que están aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se realizan sobre células muertas. La coloración de células muertas requiere un proceso previo de fijación, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos.

TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES Colorantes ácidos: tienen una especial afinidad por las estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la hemoglobina (eosina). Colorantes básicos: tienen una especial afinidad por las estructuras ácidas de las células, como por ejemplo los ácidos nucleicos (azul de metileno). Colorantes neutros: son sales de un ácido y de una base coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro (eosinato de azul de metileno). Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y tiñen a aquellas sustancias que tienen un poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante (Sudán III)

También hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polícromas. Una coloración es panóptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras. Y es pancrómica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas. El empleo combinado de los colorantes May Grunwald y Giemsa se conoce con el nombre de tinción panóptica de May Grunwald Giemsa. Se basa en el uso de soluciones preparadas a base de colorantes de acentuado poder policromatófilo y metacromático Fundamento: Se basa en el agregado de la solución de May Grunwald formada por eosinato de azul de metileno en alcohol metílico , la que fija el extendido y tiene afinidad por los citoplasmas. Luego se agrega el colorante Giemsa diluido (en el momento de realizarse la coloración), Esta constituido por Azures que son derivados por oxidación del azul de metileno. Tiene afinidad por los núcleos y ciertas granulaciones. La eosina es un colorante ácido por lo tanto tiñe los componentes acidófilos de las células. El azul de metileno es un colorante básico por lo tanto se une a las fracciones basófilas Es importante respetar las condiciones de la coloración   ya que variaciones de pH pueden alterarla. En esta coloración se trabaja a pH neutro o ligeramente alcalino. Si se trabaja a pH ácido, habrá mayor cantidad de sustancias cargadas positivamente y se absorberá mayor cantidad de eosina. Los extendidos adquieren una tonalidad rojisa. Si el pH es muy básico, habrá mayor fijación de azul de metileno y se exagerarán los colores azules.

Las reacciones citoquímicas pueden también clasificarse según el mecanismo químico involucrado 1-Progresivas estables: Son reacciones que exigen un tiempo mínimo pero no un máximo. 2-Progresivas indefinidas: En estas la reacción continúa y puede hacer ilegible el preparado o conducir a valores erróneos. 3-Fugaces: Son las que pierden color rápidamente y no pueden conservarse mucho tiempo.

CLASIFICACION DE LAS TÉCNICAS CITOQUÍMICAS CITOQUÍMICA CLÁSICA CITOQUÍMICA ELCTRÓNICA CITOQUÍMICA FLUORESCENTE INMUNOCITOQUÍMICA NO FLUORESCENTE CITOQUÍMICA AUTOMATIZADA

Citoquímica Clásica: Se fundamenta en reacciones coloreadas que pueden observarse e interpretarse con el microscopio óptico común. Citoquímica electrónica: Se caracteriza por ser una metodología de elevada sensibilidad Citoquímica Fluorescente: puede o no ser inmunocitoquímica, se fijan sobre distintas estructuras de las células y al ser excitadas por luz UV producen fluorescencias de distintos colores. Inmunocitoquímica no fluorescente:Se basa en la marcación de anticuerpos con sustancias que son capaces de dar reacciones citoquímicas intensamente coloreadas que permiten su revelación. Fisicocitoquímíca electroforética Permite reconocer determinados componentes de las organelas celulares obtenidas en solución mediante la lisis de la misma. Mediante electroforesis en un campo eléctrico y la identificación por reacciones citoquímicas, permite identificar complejos isoenzimáticos, mientras que los métodos citoquímicos simples revelan una enzima en bloque. Citoquímica automatizada: Es el fundamento de la CMF que utiliza la citoquímica fluorescente

CITOQUIMICA ELECTRONICA: Figura 1. Imagen ultraestructural (Microscopio Electrónico de Transmisión) de un folículo linfoide en las Placas de Peyer del ileon de animales que sufren una infección experimental aguda con el vDVB. Obsérvese la presencia de abundantes imágenes de apoptosis de los linfocitos, caracterizada por la condensación y marginación de la cromatina (flecha) y la fragmentación del núcleo y del citoplasma (cuerpos apoptóticos) (cabeza de flecha).

CITOQUIMICA FLUORESCENTE: INMUNES NO INMUNES P S

INMUNOCITOQUíMICA NO FLUORESCENTE

CITOQUIMICA AUTOMATIZADA:

CONSIDERACIONES PRACTICAS Conservación de la muestra (FAL) Condiciones de la reacción Observación la microscopio (ausencia/presencia/,morfología/distribucion) Interpretación (score o ausencia/presencia) Estandarización Reactivos utilizados

Pueden ser reconocibles…. SUSTANCIAS RECONOCIBLES:   1-DNA Y RNA. 2-PROTEINAS. 3-HEMOGLOBINA. 4-HIDRATOS DE CARBONO. 5-LIPIDOS. 6-FOSFOLIPIDOS. 7-METALES ENZIMAS RECONOCIBLES 1-MIELOPEROXIDASAS (MPO) 2-FOSFATASA ALCALINA (FAL) 3-FOSFATASA ACIDA (FAC) 4-ESTERASAS (EST) 5-FOSFATASA ACIDA TARTRATO RESISTENTE (FAC-TR) 6-DEHIDROGENASAS (DH)

CITOQUIMICA CLASICA Reconocimiento de principios no enzimáticos: Hidratos de carbonos: PAS Fe hemosiderínico: PERLS Lípidos: Red Oíl/Sudan Black Hemoglobina fetal: elución acida

Reconocimientos por principios enzimáticos: MPO FAL FAC ESTERASAS CATALASAS ENZIMAS HIDROLITICAS

1) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO ENZIMATICOS TINCIONES CLASICAS: 1) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO ENZIMATICOS

TINCIÓN DE PAS (Peryodic Schiff Acid) Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los carbohidratos por la acción del ácido peryódico, potente agente oxidante, liberándose grupos aldehído que al combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de color rojo púrpura intenso. -C-C- ALDEHIDOS “PURPURA” ACIDO PERYODICO SCHIFF Los precursores linfoides normales son negativos, sin embargo en procesos leucémicos los linfoblastos son positivos

PAS en neutrofilos con un patrón difuso Progenie linfoide normales (-) Hasta llegar al linfocito donde un 30% es (+) en corona de gránulos Linfoblastos leucémicos (+) Positividad en mazacotes Serie roja normal (-) Serie roja anormal (+) [LMA6] Serie granulocitica (+) difusa PAS en neutrofilos con un patrón difuso

LMA6 (eritroide) MO “PAS”: todos los precursores eritroide contienen glucógeno, nunca los normales.

Reacción de PAS, médula ósea Reacción de PAS, médula ósea. Gránulos gruesos en el citoplasma de los linfoblastos.

TINCION DE PERLS Los gránulos de hemosiderina detectables citoquímicamente mediante la reacción de Perls. Se basa en la liberación de los iones férricos de su unión con las proteínas por la acción del ácido clorhídrico; dichos iones férricos al reaccionar con el ferrocianuro potásico dan un precipitado azul verdoso de ferrocianuro férrico. Por esta reacción se detecta el Fe hemosiderínico, que es insoluble, pero no el Fe contenido en la ferritina que es hidrosoluble.

Sideroblastos en anillo Reflejando una anormalidad en la acumulacion de Fe en las mitocondrias (azul de prusia)

HEMOSIDENURIA: hierro liberado en orina en una HPN

nº de sideroblastos, tipo de los mismos y Fe macrofágico. En el estudio del Fe medular hay que valorar conjuntamente 3 parámetros: nº de sideroblastos, tipo de los mismos y Fe macrofágico. Básicamente se presentas 3 patrones: 1) nº sideroblastos alto y Fe de depósito aumentado: es frecuente hallarlo en estados anémicos que cursan con sobrecarga férrica. 2) nº sideroblastos bajo y Fe de depósito disminuido o ausente: es el patrón característico de la anemia ferropénica pura; de aparición muy precoz en un balance férrico negativo. 3) nº sideroblastos bajo con acúmulo de Fe en los macrófagos medulares. Este patrón disociado es propio de entidades que condicionan un bloqueo del Fe a nivel de los macrófagos, por lo que el Fe no puede ser cedido a los eritroblastos, suele observarse en anemias secundarias.

(cortes histológicos de hígado) Hemocromatosis (cortes histológicos de hígado)

HEMOGLOBINA FETAL Test de Kleihauer-Betke La hemoglobina fetal (HbF o 22) es ácido y álcali resistente. Por consiguiente, sometiendo un preparado fresco de sangre a una elución ácida será arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloración de estos últimos. Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean con eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacías y aparecen como sombras.

Esta prueba se usa para determinar si hay GR del feto en una mujer embarazada con un grupo sanguíneo Rh(-).

SUDAN BLACK / RED OIL Ambas se utilizan para la detección de lípidos, en el caso del Sudan Black este tiñe los fosfolípidos y esteroles de membrana de los gránulos.

Tiñe tanto los gránulos azurófilos inespecíficos como los específicos de los neutrofilos

LMA2 (con eosinofilia t(8;21): intensa tinción de las células en maduración y de los gránulos de los eosinofilos anormales.

2) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS ENZIMATICOS

MIELOPEROXIDASA La demostración citoquímica de esta enzima se basa en la acción oxidante de la peroxidasa sobre un sustrato (bencidina) en presencia de peróxido de hidrógeno, apareciendo un precipitado azul en el lugar del citoplasma en donde se ha producido la reacción. BENCIDINA H2O2 MPO

Resultados…. ERITROCITOS Y SU PROGENIE : NEGATIVOS GRANULOCITOS Y SU PROGENIE : MIELOBLASTOS AGRANULARES 30% POSITIVOS. NEUTRÓFILO ES SIEMPRE POSITIVO 100% ?? EOSINÓFILO TAMBIÉN , PERO COLOR PARDO AMARILLO BASÓFILO EN 50% LINFOCITOS Y SU PROGENIE: NEGATIVOS MONOCITOS: POSITIVOS EN GRÁNULOS DISPERSOS.

“ESTRES OXIDATIVO” Scorificación de MPO en granulocitos: Se categorizaron los neutrófilos de acuerdo al contenido de gránulos presente en el citoplasma, en scores que van de 0 a 4, en orden creciente. Grado 1: Escasas granulaciones teñidas dispersas (fig.3 y 4) Grado 0: Sin granulaciones teñidas. (fig. 1 y 2)

Scorificación de MPO en granulocitos: Grado 3: abundantes granulaciones teñidas en todo su citoplasma sin llegar a cubrir completamente el núcleo. (fig.6 ) Grado 2: Regulares granulaciones sin cubrir el núcleo (fig. 5)

Scorificación de MPO en granulocitos: Grado 4: granulaciones que cubren la célula completamente dándoles un aspecto de casquete. (fig.8 y 9)

FOSFATASA ALCALINA La fosfatasa alcalina es una hidrolasa perteneciente al grupo de las fosfomonoesterasas. Ligeros cambios de pH determinan una rápida inactivación de la enzima. Es un marcador de granulaciones secundarias o especificas.

La demostración citoquímica se basa en la hidrólisis de ciertos substratos, de los cuales se liberan unos productos intermedios que combinados con una sal diazoica dan un precipitado coloreado.

. Se encuentran actividad FA en algunas células maduras y semimaduras de la granulopoyesis neutrofilica (segmentados y bandas) La actividad granulocitica de la FA se manifiesta en forma de un precipitado de color pardo negruzco localizado en el citoplasma

Índice de actividad de FAL Grado 0: sin reacción Grado I: coloración difusa o con pequeños puntos coloreados Grado II: mayor densidad cromática, por lo general en la zona del hilio nuclear. Grado III: mayor granulación oscura, tiñe todo el citoplasma. Grado IV: completamente oscuro No todos los granulocitos presentan el mismo grado de positividad; en función de este dato se establece un índice de actividad de FA. Se pueden distinguir tres tipos de reacción: - grado 0: sin actividad enzimática. - grado I: con cierta actividad enzimática en forma granular única o actividad débil difusa en una parte del citoplasma, especialmente en la zona perinuclear. - grado II: intensa actividad granular o actividad difusa distribuida por todo el citoplasma granulocítico. Se realiza un recuento sobre 100 granulocitos asignando a cada uno un grado; y a cada grado se la asocia un valor: grado 0=0, grado I=1, grado II=2. Se suman los valores y el número obtenido es el índice de FAG, que tiene un valor mínimo de 0 y máximo de 200. El índice normal oscila entre 20 y 40. Su máximo interés se centra en el estudio de los síndromes mieloproliferativos, sobre todo para corroborar el diagnóstico de LMC para la que se designan valores muy bajos o nulos. Su determinación es muy útil para establecer el diagnóstico diferencial entre LMC y reacciones neutrofílicas secundarias que cursan con valores elevadísimos.

En el citoplasma de los No contienen gruesos granulos que forman un denso precipitado de color pardo oscuro esto demuiestra una intensa actividad de FAL esto es una PV

naftol-AS-Bi-fosfato. FOSFATASA ACIDA Se basa en la hidrólisis del substrato naftol-AS-Bi-fosfato. La aplicación práctica del estudio de la FA se refiere sobre todo al estudio de los síndromes linfoproliferativos crónicos (LPC) y leucemia aguda linfoblástica (LAL), dónde existe una buena correlación entre el tipo de positividad y el fenotipo de membrana.

FAC LT(+) Y LB (-) El 90% de las LAL de origen T dan una reacción + intensa de localización centrosómica. La LLC-T y otros SLPC T suelen cursar con valores elevados de FAC que es tartrato sensible. La LLC-B presenta muy escasa actividad al igual que ocurre con otras proliferaciones de linfocitos B.

Tricoleucemia: Tinción fosfatasa ácida (+) tartrato resistente La tricoleucemia es un proceso linfoproliferativo en que el estudio de la FA ofrece un particular interés por cuanto la actividad enzimática a pesar de ser una célula linfoide es difusa, intensa y tartrato resistente. Tricoleucemia: Tinción fosfatasa ácida (+) tartrato resistente LLA-T: INTENSA ACTIVIDAD CENTROSOMICA DE FOSFATASA ACIDA EN MAS DEL 70 % DE LOS BLASTOS.

ESTERASAS 4 sustratos: hidrolizados “precipitado insoluble” Naftol-AS-C-cloroacetato (CAE) Naftol-AS-D-acetato α-naftil-acetato Α-naftil-butirato hidrolizados “precipitado insoluble” “sal diazoica”

ESTERASAS GR y su progenie Granulocitos y su progenie Son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar ésteres en sus componentes ácidos y alcoholes. Existen diferentes variedades según el substrato empleado. GR y su progenie Granulocitos y su progenie Linfocitos y su progenie Monocitos y su progenie Naftil butirato/ acetato Normales (-) (+) M6 (-) o con algunas granulaciones F Resit (-) o + débil (+++++) Fluoruro sensible Naftil cloro acetato Idem (-) (+)

LMA3 hipergranular (MO) “CLOROACETO ESTERASA”: notese la intensa coloración confirma la maduración después del estadio de blasto

LMA5 (monocitica) MO “TINCION DE ESTERASAS COMBINADAS”: monoblastos teñidos de marrones (esterasas no especificas) y un neutrófilo teñido de azul (cloroacetoesterasa)

EN RESUMEN….. Granulocitos Linfocitos Monocitos Plaquetas Eritrocitos Mb  Seg Lbl  Lin Mbl  Mon Mg  Pq PEbl  GR PAS Fe MPO FAL FAC ANAE NCAE Sudan Black

MUCHAS GRACIAS!