Activación de factores de transcripción FoxOs por SIRT1 e inducida por AMPK reduce los niveles de ROS en células endoteliales microvasulares de placenta humana provenientes de embarazos con Diabetes Mellitus Gestacional. Cristóbal Dünner M. Tutor: Dra. Mary Carmen Vázquez R.

 DIABETES GESTACIONAL (DMG) Se define como una intolerancia a la glucosa que se descubre durante el embarazo  Incidencia: En los EE.UU. se ha estimado que del 2 al 10% de las mujeres embarazadas el año 2010 padecieron de DMG  En la población general chilena, se reportó una prevalencia del 5,1% para DMG el año Buchanan T et al, (2007) Diabetes Care 30: Ministerio de Salud, Minsal 2015 Guía Perinatal [Internet] Disponible en Bardenheier B, (2013) Diabetes Care. 36:1209–1214 INTRODUCCION

Sobre la Madre  Hiperglicemia e hiperinsulinemia  Incremento del riesgo de padecer Diabetes tipo 2 Peruchini D et al 1999 British Journal Medical 319: Sobre el Feto  Hiperglicemia e incremento del riesgo de macrosomía 3 Sobrevía L et al 2011 Placenta 25: EFECTOS DE LA DMG EN MADRE Y FETO Controversias con la diabetes gestacional- Mesa del EASD Lisboa 2011

4 Murthi P et al 2007, Placenta 28: PLACENTA

Células HUVEC: human umbilical vein endothelial cells. Cultivo primario y Linea celular Células h-PMEC : placental microvascular endothelial cells. Cultivo primario 5 Murthi P et al, 2007 Placenta 28: Guzman E et al, 2016 Purinergic Signal 12: MODELOS DE ESTUDIO EN PLACENTA in vitro Grandes Vasos: Macrocirculación Pequeños Vasos: Microcirculación

Hiperglucemia  Glicosilación de proteínas  Vía de los polioles  Mecanismo antioxidante  Productos finales de la glicosilación avanzada (AGEs) ESTRÉS OXIDATIVO  O 2  Auto-oxidación de la glucosa Adaptado de Watts G et al 1998, Atherosclerosis RELACIÓN DE HIPERGLICEMIA y ESTRÉS OXIDATIVO Gómez S., Universidad baja California. Linkedin

Forkhead box domain, subfamily Others, FoxO, han sido implicados en la inducción de respuestas de supervivencia celular, y a la protección de las células contra el estrés oxidativo. 7 Osbil T et al 2003, Journal of Biochemistry 42: MARCADORES ASOCIADOS A LA REGULACIÓN DE ESTRÉS OXIDATIVO: FoxO 1, 3 y 4 Adaptado de Nemoto S et al 2002, Science Citoplasma núcle o Fox O AcAc Activo Inactivo Translocación La actividad transcripcional es regulada a través de modificaciones postraduccionales, incluyendo fosforilación, acetilación. Essers M et al 2004, The EMBO Journal 23:

8 Lappas M et al 2010, Placenta 31 : Lappas M et al 2009, Placenta 30 : EXPRESIÓN DE FOXOS 1, 3 Y 4 EN TEJIDO DE PLACENTA HUMANA FoxO3FoxO4 FoxO1 qRT-PCR. para A) FoxO3 y (B) FoxO4 se muestra el nivel de expression del mRNA para cada marcador ubicado en placenta humana, amnion y choriodecidua respectivamente. La significancia estadistica se indica en la figura: *P < 0.05 vs. placenta; §P < 0.05 vs. choriodecidua A) B) C) Inmunohistoquímica correspondiente a la localización de FoxO1 en placenta humana, porción materna. Escala 100 µm C)

 Presente en órganos tales como el ovario, endotelio, y Placenta  En el caso de SIRT1, se encuentra en el núcleo pero puede cambiar de ubicación, como ocurre en la condición de resistencia a insulina, hacia el citoplasma Michishita et al., 2005 Mol Biol Cell 16:4623– SIRTUINA 1 Yang Xi et al 2016, Journal Biological Chemistry Journal of Diabetes Research, 2014: Ensayo de actividad de SIRT1, luego del tratamiento de células HUVECs con 100 μM de peróxido de hidrogeno por 48 horas. La significancia estadística corresponde a * p<0.05 vs. grupo Control; # p<0.05 vs. grupo H2O2 ; ** p<0.05 vs. grupo Control. Yun J et al 2012,Journal Nutric. bioch. 23:699–705.

10 FoxO 1, 3 y 4 Adaptado Padgett L et al 2013, Cell Research 36:1716–1726. p300 ROS activa Mortuza R 2013 PLoS One 8: e DESACETILASA /ACETILASA/ FOXO/ ROS AC

11 Efecto de SRT2104 sobre SIRT1 y además sensibilización a la a insulina

12 Van der Horst et al. 2006, Biochemistry380: REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE FoxO 1, 3 y 4 MEDIANTE ACETILACION Y DESACETILACION Stress oxidativo SIRT1 p300 FoxOs Ac Inactivo activo

 Se ha descrito la actividad de AMPK en placenta humana. Monroe M Endocrine Society's 98th Annual Meeting and Expo, April 1–4, 2016 – Boston  En condiciones de privación de glucosa hace que cambie la relación AMP/ATP, lo que activa a la AMPK  AMPK activa SIRT1 Oakhill J et al 2011,Science 332: AMPK y estrés oxidativo? 13 CINASA ACTIVADA POR AMP O AMPK Modificado de Hermann R et al 2015 Rev. Cardiolo 44: e21-e24

14 ACTIVACIÓN DE AMPK PUEDE OCURRIR EN RESPUESTA AL ESTRÉS OXIDATIVO Choi S et al 2001 Biochem Biophys Res Commun, 287: 92–97 Los resultados sugieren que la AMPK es altamente sensible al estrés oxidativo y a la relación AMP: ATP celular a b

15 Bhaskar Ponugoti, et al 2012, Diabetes Care. 36:1209–1214 AMPK/SIRTUINA 1 / FoxOs y STRESS OXIDATIVO Regulación Stress oxidativo (SOD) SIRT1 AMPK Acetilación Desacetilación El daño endotelial en DMG ha sido reportado

La activación de SIRT1 mediada por AMPK disminuye la concentración de especies reactivas de oxígeno por activación de los factores de transcripción FoxO 1, 3 y 4 en células endoteliales microvasculares de placenta humana de pacientes con Diabetes Mellitus Gestacional 16 HIPOTESIS Evaluar el efecto de la activación de SIRT1 por medio de AMPK, sobre la producción de ROS mediante la desacetilación de FoxOs 1, 3 y 4 en células endoteliales hPMEC provenientes de embarazos normales (control) y con DMG. OBJETIVO GENERAL

1. Evaluar la actividad de SIRT1 y AMPK en cultivos de células hPMEC provenientes de embarazos con y sin DMG 2. Evaluar la actividad de SIRT1 en presencia de inhibidor de AMPK en cultivos de células hPMEC provenientes de embarazos con y sin DMG. 3. Analizar la variación de los niveles de ROS en cultivos de células hPMEC provenientes de embarazos con y sin DMG en presencia y/o ausencia de inhibidor de AMPK. 4. Analizar la variación de los niveles de ROS en cultivos de células hPMEC provenientes de embarazos con y sin DMG en presencia y/o ausencia del activador de SIRT1 5. Determinar los niveles de acetilación y desacetilación de FoxOs 1, 3 y 4 por SIRT1 en cultivos de células hPMEC provenientes de embarazos con y sin DMG. 17 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obtención de muestras de Placenta N=6-8 ( Lappas et al 2009, Placenta 30: ) ) Embarazos normales 40 semanas de gestación Diabetes Mellitus Gestacional (DMG) 40 semanas de gestación Voluntarias. Glicemia en ayunas de 90 mg/dl Voluntarias 140 mg/dl a 2 horas después de la carga de glucosa (75 grs) como DMG (Salomon et al 2012, PLoS One. 7, 7 e ) DISEÑO EXPERIMENTAL Las mujeres con preeclampsia, diabetes pregestacional, obesidad o algún tipo de patología asociada a la placenta fueron excluidas en este estudio.

19 Anti- CD31 Primary culture medium OBTENCIÓN DE CÉLULAS hPMEC Medio M199 Salomon C et al 2012, PLoS ONE Tejido placenta embarazos normales y con DMG Tripsina y colagenasa Beads

Obtención de extractos citoplasmáticos ( centrifugación diferencial) de células hPMEC en embarazos con y sin DMG qPCR y Controles : ( -)Sirtinol, TSA (+) Presencia / ausencia de SRT2104 (1h) SIRT1 Actividad SIRT1. DO v/s ng de proteína Sonda : residuo de lisina. Placa de ELISA. Ensayo Colorimétrico Controles: (-) inhibidor LKB1 (+) 50µm AMP Presencia / ausencia de BML- 275 (24 h) AMPK Actividad AMPK DO v/s ng de proteína Sonda : residuo serina. Placa de ELISA. Ensayo Colorimétrico Control: (-) sirtinol (+) células +H2O2 Presencia / ausencia de SRT2104 (1h) Detección de ROS 1mM DCH2F-DA, 60 min a 37°C Placa de ELISA, Espectrofluorímetro Obj 2 obj3 obj4 obj1

Citometría Fo xO1 Fo xO3Fo xO4CD31SIRT1 FITCBiotinaCy5.5 Anti acetil ε- lisina FITC CD31 SIRT1 FoxO 4 ε acetil lys FoxO 3 ε acetil lys Determinar los niveles de acetilación y desacetilación de FoxOs 1, 3 y 4 por SIRT1 en cultivos de células hPMEC provenientes de embarazos normales y con DMG. Obj 5

 Células 293 T, fueron tratadas con H 2O2 500µM por 1 h  Anti-SIRT1 (Upstate Biotechnology), 22 Brunet A, et al. 2011, Science 303: PRUEBA COMPLEMENTARIA : INMUNOPRECIPITACIÓN PARA FOXOs Y SIRT1

Para evaluar la asociación entre las variables de interés se realizó análisis de correlación Multivariado ESTADÍSTICA Software estadístico GraphPad INSTAT 3.0b y 6.0a GraphPad Prism (GraphPad Software Inc. EE.UU.) Prueba de normalidad Kolmogorov-Smirnov Los valores de las medidas se expresarán como media ± S. D con p value <0.05 como significativo ANOVA

 Vía terapéutica alternativa contra stress oxidativo para mujeres con DMG  Posible terapia con el activador de SIRT1, SRT2104 potenciando la desacetilación de FoxO 1, 3 y 4  Modelos propuestos 24 PROYECCIÓN

MODELO: Células hPMEC provenientes de embarazos NORMALES SIRT1 AC

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30  SIRT1 promueve la supervivencia celular desacetilando proteínas como FoxO, lo cual es requerido para la respuesta normal a estrés oxidativo (Essers M et al, 2004, Chen Z 2013). Se ha reportado, más aún, que SIRT1 aumenta la actividad de SOD por medio de desacetilación de FoxO 3 y 4 (Van der Horst A, et al 2008, Cantó et al, 2010 ). En el caso de FoxO1, su acetilación es llevada a cabo por la HAT, p300; mientras que su desacetilación es responsabilidad también de SIRT1 (Daitoku H et al, 2011). S  Sin embargo, no hay antecedentes en las células hPMEC en relación a la desacetilación y activación de FoxOs 1, 3 y 4 mediante SIRT1 en placenta de mujeres con DMG. Por otro lado, en cultivo celular de fibroblastos humanos, se comprobó que en ausencia de estrés oxidativo la ubicación de FoxO3 es citoplasmática, pero luego de estimularse con H2O2 presenta una localización nuclear, producto de la interacción con SIRT1 (Brunet et al, 2005). Además, se ha demostrado mediante inmunohistoquímica, la presencia SIRT1 en el citoplasma en células del sincitiotrofoblasto de la placenta, correspondiente a la cara materna de ésta, de manera que es un candidato para el estudio en células endoteliales microvasculares de placenta (Lanpass et al, 2011).

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 Para la inmunoprecipitación de proteínas, para lo cual 2x10 7 células se lisaran en tampón de lisis. Los extractos celulares se sometieran a inmunoprecipitación con un anticuerpo monoclonal anti-acetil lisina y, anti FoxO 1, 3 y 4. Los complejos inmunes se analizaran por Western Blot. 44

45 Peruchini D et al, 1999 British Journal Medical Sobrevía L et al, 2011 Placenta RELACIÓN DE HIPERGLICEMIA y ESTRÉS OXIDATIVO Kobayashi et al 2005 Int J Mol Med Estrés

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48 CD31 SIRT1 FoxO 4 ε acetil lys FoxO 3 ε acetil lys GRÁFICOS DE CITOMETRÍA

 Células provenientes de embarazos normales y con DMG:  Se trataran 2-5 x 10 7 con y sin SRT2104 (100 Mm) por 1 h para cada grupo  El extracto se someterá a ensayo por citometría de flujo con anticuerpos anti-acetilaciòn en lisina para FOXO 3 y 4 mas un anticuerpo SIRT1 para muestras de embarazos normales y con DMG tratadas con los siguientes fluoróforos. 49 Determinar los niveles de acetilación y desacetilación de FoxOs 3 y 4 por SIRT1 en cultivos de células hPMEC provenientes de embarazos normales y con DMG.

50  Células serán tratadas con dichlorodihydrofluoresceina diacetato (DCH-DA) en embarazos normales y con DMG  En este estado reactivo, especies ROS pueden reaccionar con DCFH, que se oxida rápidamente a la altamente fluorescente 2,7‘ (DCF)  La intensidad de fluorescencia ( de 480 y emisiòn a 530 nm) es proporcional al total de los niveles de ROS dentro de la muestra. Davuluri, G. 2016, J Physiol. Analizar los niveles de ROS en ausencia y en presencia de Resveratrol en cultivos de células hPMEC provenientes de embarazos normales y con DMG.

51 ENSAYO DE ACTIVIDAD DE SIRT1

La hiperglicemia determina el desarrollo de complicaciones crónicas a través de varios mecanismos, entre ellos:  La formación de los productos de glicosilación avanzada o AGEs (advanced glycation products)  Los AGE actúan por unión a un receptor de superficie de membrana (RAGE) producto de la glicocilación avanzada, presente tanto en las células epiteliales como en las endoteliales. Dicha interacción AGE-RAGE provoca la generación de más ROS (Ge Q et al, 2010), activa la enzima NADPH oxidasa causando un incremento de ROS y generando estrés oxidativo que a nivel intracelular  En relación a lo anterior, existen mecanismos implicados en el incremento del estrés oxidativo en la DM2, entre los cuales se encuentran la autooxidación de la glucosa a enedioles, lo cual produce citoaldehídos con un alto poder oxidante; produciendo los denominados productos de glicosilación avanzada (AGE, por su nombre en inglés; Advanced Glication Ends).  52 DAÑO POR HIPERGLICEMIA Luo X, et al Hyperglycemic Stress and Carbon Stress in Diabetic Glucotoxicity. Aging and Disease. 7: 90–110.

 Para que el glutatión realice su acción como principal antioxidante intracelular en respuesta a especies reactivas de oxígeno (anión superóxido, radical hidróxilo y peróxidos orgánicos e inorgánicos) es requisito indispensable que mantenga su forma reducida (GSH), 34 por acción de la glutatión reductasa, sobre la forma oxidada (GSSG), lo que requiere del consumo de NADPH. Por otra parte, la activación de la catalasa 35 también depende de NADPH ( 53

 Se ha descrito que la microvasculatura fetal humana en DMG podría presentar una pérdida de la regulación fisiológica sobre el tono vascular local, lo que puede dificultar el desarrollo a nivel placentario (Lang I et al, 2003).  Esto por el efecto de los a nivel de la microvasculatura de los ROS se relacionan principalmente con daño al endotelio y músculo liso, cuyo trastornos metabólicos y hemodinámicos tienen como característica anatómica el engrosamiento de las membranas basales en los vasos capilares, lo que posteriormente conduce a un daño del tejido vascular (Baynes J et al, 1999).  Lo que pude derivar en una disfunción de las células endoteliales, y consecuentemente complicaciones materno-fetales ( Zhuang T et al, 2014) como ocurre en el caso de las mujeres con DMG (Malek A, et al 2001). 54

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57 En el metabolismo, el NAD + participa en las reacciones redox (oxidorreducción), llevando los electrones de una reacción a otra. La coenzima, por tanto, se encuentra en dos formas en las células: NAD + y NADH. El NAD +, que es un agente oxidante, acepta electrones de otras moléculas y pasa a ser reducido, formándose NADH, que puede ser utilizado entonces como agente reductor para donar electrones. Estas reacciones de transferencia de electrones son la principal función del NAD +. Sin embargo, también es utilizado en otros procesos celulares, en especial como sustrato de las enzimas que añaden o eliminan grupos químicos de las proteínas, en modificaciones post- traduccionales. Debido a la importancia de estas funciones, las enzimas que intervienen en el metabolismo del NAD + son objetivos para el descubrimiento de medicamentos. En los organismos, el NAD + puede ser sintetizado desde cero (de novo) a partir de los aminoácidos triptófano o ácido aspártico. Alternativamente, los componentes de las coenzimas se obtienen a partir de los alimentos, como la vitamina llamada niacina. Compuestos similares son liberados por las reacciones que descomponen la estructura del NAD +. Estos componentes preformados pasan luego a través de una ruta que los recicla de vuelta a la forma activa. Algunos NAD + también se convierten en nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP + ), cuya química es similar a la de la coenzima NAD +, aunque tiene diferentes funciones en el metabolismo.metabolismoenzimasproteínasaminoácidosvitaminaniacina

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Radicales libres (Normalmente producidos en el organismo) Endocrine Reviews 25(4); Peroxinitrito

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63 CARTA GANTT

 ESPER R, VILARIÑO J, MACHADO R, PARAGANO A. Endothelial dysfunction in normal and abnormal glucose metabolism. Adv Cardiol  Pennathur S, Heinecke J. Mechanisms of oxidative stress in diabetes: implications for the pathogenesis of vascular disease and antioxidant therapy. Biosci

65 RESUMEN DE RECURSOS SOLICITADOS

66 DESGLOSE PRESUPUESTO

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68 Investigador$ ,00 Gastos viajes$ ,00 Gastos operacionales $ ,00 Total a pedir $ ,00

69 REGULACIÓN DE LOS NIVELES DE GLUCOSA Björn A et al 2011Diabetes estrés

70 Foxo 3 y 4 es regulado por la acetilasa P300, que se expresa en condiciones normales. Ocurriendo la acetilación en el nucleo y posterior traslocación al citoplasma en estado inactivo ( esto lo sacare para la ppt) Esto no va a)Los niveles de glucosa aumentados, se presenta stress. Los ROS se encuentran aumentados en DMG por una disminución de la desacetilación de FoxO, que no es suficiente para compensar el aumento de ROS  b) Resveratrol potenciaría efecto de SIRT1 y por tanto los niveles de ROS disminuidos, además hay aumento de la desacetilacion de Foxos y por lo tanto su activación

71 2DA MITAD DEL EMB. AUMENTA RESISTENC IA A LA INSULINA DIRIGIR NUTRIENTE S AL FETO GENERALIDADES

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 Por otra parte, se ha demostrado que el estrés oxidativo induce la interacción y subsiguiente deacetilación del factor FoxO3a por SIRT1 en al menos cinco residuos de lisina distintos, lo que promueve su translocación del citoplasma al núcleo. (Brunet et al., 2004; Motta et al., 2004; van der Horst et al., 2004). 75

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78  La vía de los polioles, mostrada esquemáticamente en Fig. 2, focaliza sobre la enzima aldosa reductasa. La aldosa reductasa normalmente tiene la función de reducir aldehídos tóxicos de la célula a alcoholes inactivos, pero cuando la concentración de glucosa aumenta, también reduce glucosa a sorbitol, que más tarde es oxidado a fructuosa. En el paso de reducir glucosa a sorbitol, la enzima consume el cofactor NADPH como se muestra en la Fig. 2. NADPH es también cofactor esencial para regenerar un crítico antioxidante intracelular, glutatión reducido. Por reducir la cantidad de glutation reducido, la vía de los polioles incrementa la susceptibilidad intracelular al stress oxidativo.Fig. 2

 Podemos decir que estos mecanismos son específicos, por cuanto que tienen sustratos también específicos, no obstante hay sistemas de desintoxicación menos específicos –aunque no por ello menos eficientes–. Este sería el caso de moléculas orgánicas de pequeño tamaño tales como el glutation, un tripéptido (ac.glutámico- cisteína-glicina) que interviene en numerosas reacciones de óxido-reducción. En él la parte que se oxida son los grupos tiólicos (R-SH) de la cisteína. El glutation inactiva sobre todo H2O2 y además actúa sobre hidroperóxidos orgánicos (R-O-O-H), haciéndolos menos tóxicos y más solubles, por lo que contribuye a la “desintoxicación” con intervención de la glutation peroxidasa. El paso de glutation oxidado (glutation-S-S glutation) a glutation reducido (glutation-SH) lo cataliza la glutation reductasa que toma los electrones del NADPH (Figura 16). La glutation peroxidasa contiene un átomo de selenio, por ello se considera que, en este sentido, el selenio favorece indirectamente la defensa antioxidante del organismo. La eliminación del H2O2 en los diferentes tejidos se lleva a cabo tanto por el glutation reducido como por la catalasa, aunque la contribución de cada uno de los sistemas está sometida a fluctuaciones en función del tipo de tejido y de otros factores.  79

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82 activity-and-increases-oxidative-stress-leading-to

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 La membrana interna llamada amnios contiene el líquido amniótico y el feto en su interior. La membrana exterior, llamada corion, contiene el amnios y es parte de la placenta. 84

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