Ethel Guerrero-Víctor Vidal Inmunoensayos Análisis forense Servicio Medico Legal Santiago,Chile Ethel Guerrero-Víctor Vidal

Test preliminares Basados en la exactitud de los hallazgos analíticos, un procedimiento analítico puede ser considerado preliminar o método concluyente. Los métodos de análisis preliminares son útiles para propósitos de “screening”

Los ejemplos típicos de la categoría Test preliminares Los ejemplos típicos de la categoría de métodos preliminares donde no es necesaria la instrumentación son Test de color y los inmunoensayos de panel

Métodos preliminares que requieren instrumentación Radio inmunoensayo Test preliminares Métodos preliminares que requieren instrumentación Radio inmunoensayo Enzimo inmunoensayo Fluorescencia polarizada Luminiscencia

El protocolo en el cual es usado un método preliminar, requiere de dos pasos cuando un resultado es positivo Los presuntivos positivos tiene que ser testeado para una droga especifica y sus metabolitos por cromatografía gaseosa /espectrometría de masas Solo esas drogas pueden ser reportadas como positivas

Valores de corte Si se utiliza un inapropiado valor de corte (cutoff) Si es adoptado un bajo nivel de corte, habrá un exceso de resultados negativos analizados por GC/MS Por el contrario si el cutoff es muy alto en el test preliminar, las muestras positivas pueden ser reportadas como negativa sin el proceso de GC/MS Causando al proceso de testeo de drogas una técnica ineficiente

ADULTERANTES La presencia de adulterante comunes y accesibles afectan la respuesta del común de los inmunoensayos . El efecto del adulterante varía con la categorías de las drogas testeada y la metodología de inmunoesayos usados Los adulterantes que causan interferencias significativas han sido revisada (1) 1.Cody J T, : Specimen adulteration in drug uranalysis ; forensic Sci Rew 2:63,90

Adulterantes sustancia cantidad método droga muestra efecto ref amonio 5,10% 5,10,14% 10% 14% RIA FPIA COC THC BAR - +/- - - +++ +++/++ +++/+ 2 2,3 3 4 Hidróxido de potasio 0.5,5M 5M ++++ Bicarbonato de sodio 40mg/ml EMIT AMF, + ++ 5

adulterantes sustancia cantidad método droga muestra efecto ref Blanqueador liq 12ul/ml 23UL/ML 24ul/ml 125ul 10% 5% 50% 5,10,50% EMIT RIA FPIA THC AMF BAR OP COC BEN THC OP + - +/- - - - - - - - -- - - - - - +++++ ---- 6 2 3

adulterantes sustancia cantidad método droga muestra efecto ref Vanish 1-10% 5% 10% RIA FPIA AMF,OP THC + - -- +++ 2 4 Detergent iónico 10-5% COC BAR +/- ++ Vinagre 125ul/ml 0.5gotas/ml 50% EMIT -f --- 6 7 3

adulterantes sustancia cantidad método droga muestra efecto ref SAL 025% 50mgml 50mg/ml 75mg/ml 10% EMIT THC OP,BAR AMF COC OPI BEN BAR A,BARCOP,THC + +/- -f ---- -- 7 8 9 6 2 4

Adulterantes I sustancia cantidad método droga muestra efecto ref Detergente y jabón liq 1got/10ml EMIT THC + -f 7 1got/5ml 10% RIA +/- +++ 2 5-10% ---- 3 FPIA - ++ 3,4 BAR ++++ 4

Adulterante II cantidad método droga muestra efecto ref 12ul/ml EMIT THC + ---- 4 23ul/ml BAR 42ul/ml BEN 2% THC,BEN +/- 9 ++ RIA ++++ FPIA ANF,BAR,THC,BEN +++

sustancia cantidad método droga muestra efecto ref Fosfato 5%10% 5% 10% 10% RIA FPIA COC THC AMF BAR OP + +/- ---- +++ ++ 2 4 Etilen glicol 20% 9 2-propanol 50% 3

adulterantes sustancia cantidad método droga muestra efecto ref Etanol 20% RIA FPIA THC + 9 SANGRE 1gota/10ml 10% EMIT +/- - -- 7 4 Ácido ascórbico AF OP -f 2 3

adulterantes sustancia cantidad método droga muestra efecto ref Visine 125ul/ml 107ul/ml 10% EMIT RIA FPIA THC BEN + ---- --- -- 6 2 7 Agua oxigenada 6ul/ml +/- ++ 9

Adulterantes La mayoría de los estudios analizados no han comparado los efectos de los adulterantes bajo las mismas condiciones Dificulta hacer declaraciones generales concerniente a la robustez de una metodología sobre otra. Sin embargo los ensayos de marihuana son más susceptibles a los efectos de los adulterantes

Realidad Médico Legal En el departamento de laboratorios de Santiago se realizaron 6762 pericias toxicológicas de los cuales 33% de estas pericias, no es para determinar la causa de muerte, sino para entregar más elementos a la investigación 1007 corresponden a informes sobre consumo de drogas de abuso

Análisis toxicológico Grupo G1 tanatología Diagnóstico de muerte por arma blanca, arma de fuego, golpe contundente y atropello clínica y sexología forense pericias que corresponde a consumo de drogas de abuso, psiquiatría forense son sometidas a un rastreo de drogas de abuso incluyendo alcohol

Toma de decisión La Administración de Justicia necesita de respuestas oportunas debido a la gran cantidad de peritajes, se tomó la decisión de utilizar la técnica de inmunoanálisis, para el rastreo de drogas de abuso. por GC-MS considerada actualmente el “gold standar” de la técnicas confirmatorias.

INMUNOENSAYOS en la actualidad la mayoría de los laboratorios forenses realizan screening de drogas de abuso mediante técnicas de inmunoensayo debido que dichas técnicas presentan una elevada sensibilidad y son rápidas de usar (10)

Orina La orina es el fluido biológico preferido para el análisis de uso de drogas ilegales y sus metabolitos. Mientras la tendencia reciente ha sido aplicar tecnología de laboratorio a nuevos medios biológicos, debería tenerse en cuenta que el análisis de orina es una tecnología bien conocida en la que la mayoría de los problemas ha sido descubiertos y resueltos ,o por lo menos , definido.

Orina La importante ventaja de la orina para los test de detección de drogas es que generalmente esta disponible en cantidad suficiente, es fácil de recoger y las drogas y sus metabolitos tienden a estar presente en concentraciones relativamente altas

Comparación de inmunoensayo y equivalencia Cada analito de los paneles fue evaluado en comparación entre panel EMITR y CG/MS Todos los resultados fueron confirmados por CG/MS

Opiáceos 8 87.5% 70 100% 78 98.7% 7 100% 70 100% 77 100% PANEL EMIT(+) TOTAL (+) 7 (-) 1 70 71 8 87.5% 70 100% 78 98.7% PANEL CG/MS(+) CG/MS(-) TOTAL (+) 7 (-) 70 7 100% 70 100% 77 100%

Cocaína 34 97% 66 100% 100 99.0% 29 100% 71 94.3% PANEL EMIT(+) TOTAL (+) 33 (-) 1 66 67 34 97% 66 100% 100 99.0% PANEL CG/MS(+) CG/MS(-) TOTAL (+) 29 4 33 (-) 67 29 100% 71 94.3% 100 96%

Marihuana THC PANEL EMIT(+) EMIT(-) TOTAL (+) 32 (-) 6 63 69 38 84.21% (-) 6 63 69 38 84.21% 63 100% 101 98.4% PANEL CG/MS(+) CG/MS(-) TOTAL (+) 30 2 32 (-) 69 30 100% 71 98.3% 101 99%

ANFETAMINAS PANEL EMIT(+) EMIT(-) TOTAL (+) 25 (-) 3 70 73 28 89.2% (-) 3 70 73 28 89.2% 70 100% 98 97% PANEL CG/MS(+) CG/MS(-) TOTAL (+) 21 4 25 (-) 73 21100% 81 90.1% 98 96%

METANFETAMINAS PANEL CG/MS(+) CG/MS(-) TOTAL (+) 14 1 (-) 26 14 100% 26 14 100% 27 97% 3098.3%

Cada método de screening tiene sus ventajas y desventajas Unos u otros pueden ser más económico bajo diferentes series de circunstancias Cada laboratorio tendrá que considerar esas circunstancias y elegir el método que le entregue el screening mas eficiente para un grupo de drogas en particular

SANGRE La sangre es considerada como la muestra más útil para la identificación de drogas en análisis cuantitativo. Dado que Las sustancias psicoactivas que se testean a menudo abandonan la sangre rápidamente esta es más útil para para la identificación del consumo reciente Generalmente los valores de están en la sangre en concentraciones bajas, típicamente en un rango de 5ng (10-9) -5mg(10-6)

sangre Existen diversos procedimientos de detección de drogas en sangre para las drogas que se abusa más frecuentemente La CL es una de las técnicas más empleadas, ya que es capaz de identificar al mismo tiempo diversos compuestos similares La GC-MS por si misma permite el análisis de sangre pero se debe realizar una derivatización para incrementar la sensibilidad

inmunoensayo Los inmunoensayo para las drogas de abuso están diseñados para la determinaciones en orina y en sangre, Es con la sangre con lo que la versatilidad y la sensibilidad del RIA y posteriormente del ELISA son particularmente ventajosa

Sangre En1978 se publicó la aplicación de inmunoensayo a un fluido distinto de la orina (10).desde esa fecha la comunidad toxicológica ha manifestado interés hacia la aplicación de los inmunoensayos a diversas muestras biológicas como; suero , sangre total, bilis, humor vítreo y tejidos (11) La extensión de los inmunoensayos a las muestras de sangre conlleva la modificación de los procedimientos utilizados en el análisis de orina, por lo que las muestra de sangre total no pueden ser analizadas de forma directa. Presentan altos niveles de absorbancia que interfieren con los medidas a realizar por los métodos inmunoenzimaticos, por lo que es necesario una preparación de la muestra antes de someterla al análisis(12)

sangre Durante estos últimos meses en nuestro Laboratorio ha estado desarrollando un método para detectar presencia de de drogas de abuso en sangre mediante la aplicación de técnica de inmunoensayo

DROGAS DE ABUSO ESTUDIADAS Cut-off (ng/mL) Conc. Terap. (ng/mL) LD a pH 9 LD a pH 11 ANFETAMINA 1000 200-1000 NEG(1050) 230 BENZOILECG 300 44* 20 OXAZEPAM 230* 180 NORTRIPTIL 50-250 408 FENOBARBIT 100 20000-40000 75 15 METAMFET 500-1000 NEG (1020) 968 MORFINA 10-120 207 METADONA 100-450 293+- 43 MDMA 500 500-1000* 460+- 80 COCAINA 350 NEG(1200)

referencia 11.Vogel J, Hednett CN;Detection of drugs in blood, bile and tssues with an enzyme inmunoassay technique, J Anal Toxicol,:5;307-309;81 12.Lillsunde P, Michenson L, ForsstronT, KurteT SchultzE, Ariniemi K .. Comprehensive drug screening in blood for detecting abused drugs or drug potencially hazardous for traffic safety. Forensic Scien Innt,77,191-210 13. Screenig de drogas de abuso en sangre total mediante inmunoesayo enzimático CEDIA originalmente diseñados para el análisis de orina .aplicación en caso forense.R Garcia E Moreno T Soriano

referencias 2. Cody JT Schawarzhopff R:Impact of adulterants on RIA analysis of urine for drugs of abuse; J Anal. Toxicol13:277;89 3. Bronner W,Nyman P.,von Minden D.Dectectability of phencyandclidine 11-nor-D9-tetrahidrocannabinol-9-carboxylic acid in adulteratedurineby radioinmunoassay and flurescence polarization inmunoassay; J Anal Toxicol 14:368;90 4. Schawarzhopff R, Cody JT; the effects of adulterrants agents on FPIAanalysisof urine drugs of abuse: J Anal Toxicol 17:14;93 5. WarnerM:Interference of common household chemicals i inmunoassay methods for drugsof abuse: Clin Chem35:648;89 6. MIKKELSEN s l,Ash KO: Adulterants causingfalse negative in ilicite drugs testing: Clin Chem:34:2333;88 7. Schwarts R H, Hayden GF , RiddileM:Laboratory detection marijuana use ;Am J D iseases of Children 139:1093;85 8. Kim HJ ,Cerceo E: Interference by NaCl with the Emit method od f analysis for drugs of abuse; Clin Chem: 22:1935,76 9. WarnerM:Interference of common household chemicals i inmunoassay methods for drugsof abuse: Clin Chem35:648;89 10 iwerse-Bergman A, Schomolldt: Direct semiquantitative screening of drugs of abuse in serum and whole blood by means of CEDIA DAU urine inmunoassays; J Anal Toxicol, 23;247-256:99