Electroforesis de DNA

DNA Topoisomerasas Izquierda Derecha

Enzimas de restricción Clasificadas en 3 tipos, donde la mayoría pertenece al grupo II (proteínas monoméricas, poseen simetria rotacional y generalmente requieren Mg2+ Secuencias palindrómicas Isosquisomeros: Varias enzimas diferentes que reconocen la misma secuencia, donde, algunas cortan sec blanco en diferentes posiciones. Sma I / Xma I Secuencias metiladas: A*: N6-metiladenina C*: 5-metilcitosina : Hpa II y Msp I Reconocen la secuencia CC*GG Hpa II: no digiere DNA metilado Msp I: Digiere met o no-metilado *90% de las metilaciones en genomas ocurren en 5.metilcitosina en C*G

Clonamiento de DNA

Desfosforilación de vectores (para evitar asociación intramolecular)

68 kDa DNA Ligasa Actividad se mide en Unidase Weiss (Weiss, 1968)

Ligación de extremos cohesivos

Southern y Northern blot Southern, E. M. (1975) J.Mol. Biol. 98, 503-517 Southern y Northern blot

Southern blot

Generación de cDNA

Fabricación de replicas en Nitrocelulosa e hibridación in situ (en placa) Screening: Rastreo, Escrutinio

Fago Lambda como vector de clonamiento

Clonamiento de DNA en plasmidos

DNA plasmidal PBR322

Clonamiento de DNA en plasmidos

Clonamiento de DNA en plasmidos

Eliminación de fragmentos de Okazaki

(Reacción de Nick translation) Eliminación de fragmentos de Okazaki (Reacción de Nick translation) + Mg2+ DNA pol I (E. coli) Holoenzima (monómerica) de 109 kDa. 5’  3’ Polimerasa 5’  3’ exonucleasa 3’  5’ exonucleasa Alternativamente: Marcaje por random Primer o incorporación en reacción de PCR

SINTESIS de DNA in vitro Reacción de polimerización en cadena = polymerase chain reaccion (PCR) - Un fragmento de DNA (copia de una parte del DNA templado) - Múltiples copias (de una molécula templado  1 millon de copias) - DNA polimerasa (termoestable, de Termophilus aquaticus, Taq Pol) - Partidores, un par (los partidores dan la especificidad de la reacción) - dNTPs - Tampón (Mg2+, tampón)  30 ciclos de amplificacion: denaturacion 94ºC, 30seg apareamiento, 40-60ºC, 30seg extensión, 72ºC, 30seg ESPECIFICIDAD VELOCIDAD SENSIBILIDAD CONTROLES!

SINTESIS DE DNA in vitro PCR - Iniciacion, elongacion, terminacion - in vitro INICIACION cuando y donde - multiples veces un fragmento de DNA - par de partidores sentido y antisentido secuencia especifica - DNA polimerasa termoestable TaqPol (Thermophylus aquaticus) ELONGACION ciclos de denaturacion, apareamiento, extension TERMINACION Extension final y guardar a 4ºC

PCR Taq DNA pol (Thermus aquaticus) MW 65 kDa

PCR de MICROSATELITES 5’ 3’ 5´ Partidor 1 Partidor 2 GATCGGATAACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGGTA 3’ MICROSATELITE 5’ CGACACTACCAGATG CACCTGATATCTGGTA TGTGTGTGTGTGTGTG Partidor 2 llllllllllllllll 5´ GCTGTGATGGTCTAC Partidor 1 lll111111111111 GTGGACTATAGACCAT ACACACACACACACAC GCTGTGATGGTCTAC Marcadores genéticos: Identidad, medico legal, paternidad, etc

Análisis de microsatélites 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 pb 1 2 3 4 5 6 7 120 – 140 HTG4 170 – 188 HMS7 Análisis de microsatélites de caballos 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 pb 1 2 3 4 5 6 7 149 – 172 HMS3 218 – 238 HMS2 240 250 Sistema manual en geles de poliacrilamida modificada, Spreadex® en geles de 10 cm y tinción con bromuro de etidio.

R-Loops

Microscopía Electrónica, Tinción Negativa R-Loops Microscopía Electrónica, Tinción Negativa Metodología alternativa: Ensayos de digestion con nucleasa S1, Degrada preferencialmente ssDNA o RNA. También para generar extremos romos y apertura del hairpin generado en la segunda hebra del cDNA

Replicación Viral: Circulo rodante y desplazamiento de hebra. (MET) Tinción negativa

Denaturación y Renaturación del DNA Construcción de bibliotecas de secuencias únicas

Denaturación del DNA e Hipercromicidad

Marcaje de DNA satélite en cromosomas FISH

Separación de DNA por Ultracentrifugación

Velocidad de Polimerización Secuenciación de DNA (Sanger,1977) Enzima/ Propiedades Procesividad Velocidad de Polimerización Frag. Klenow (DNA pol I) 10-50 nt 45 nt/seg Sequenasa 2000-3000 nt 300 nt/seg Taq DNA pol >7600 nt 35-100 nt/seg Klenow: MW 76 kDa, carece de actividad 5’ 3’ exonucleasa por remoción proteolítica (Klenow, 1970). Sequenasa: DNA pol T7 modificada químicamente (sin activ. 3’  5’ exonucleasa)

Secuenciación de DNA (Sanger,1977)

Secuenciación Automatizada de DNA

AFLP DNA Fingerprinting AFLP RFLP RAPD DAF SSCP Microsatellite Amplified Fragment polymorphism RFLP Restriction Fragment Length polymorphism RAPD Random Amplified polymorphic DNA DAF DNA Amplification Fingerprinting SSCP Single Strand Confirmational polymorphism Microsatellite

Análisis de Microarreglos de DNA

Microarreglos de DNA

Microarreglos de DNA Síntesis in situ y análisis in silico

Microarreglos de DNA

Expresión Génica Temporal por microarreglos de DNA